黃婉媛, 李彩斌, 彭 宇, 李章海, 黃衍章, 丁 婷*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點實驗室,作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230061;2.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司,貴州 畢節(jié) 551700;3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 煙草與健康研究中心,安徽 合肥 230026)

煙草根黑腐病的病原菌為根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola),近些年該病在貴州畢節(jié)的各煙區(qū)頻繁發(fā)生,危害逐年加重,成為當(dāng)?shù)責(zé)焻^(qū)中一類重要的土傳病害[1]。該病的發(fā)生貫穿煙草的苗期到成株期,主要侵染的部位為根系,導(dǎo)致根系腐爛、植株死亡。煙草根黑腐病近些年的不同程度流行,給當(dāng)?shù)剡M一步促進煙葉的優(yōu)質(zhì)發(fā)展帶來了很大的制約作用,當(dāng)前防治該病的主要手段之一為化學(xué)藥劑[1]。針對煙草根黑腐病菌的防治,研究人員在商品化單劑方面開展了一系列的篩選、研究工作。王文鳳[2]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),在煙草根黑腐病菌分生孢子萌發(fā)過程中,抑制效果最明顯的藥劑為多菌靈、吡唑嘧菌;田間防治效果方面,效果較明顯的藥劑為甲基托布津、多菌靈。趙永強等[3]經(jīng)過研究,認為在煙草根黑腐病菌的菌絲生長階段,抑制效果較強的藥劑有甲基托布津、多菌靈、大生M-45、殺毒礬;而多菌靈與大生M-45交替施用可使用藥的效果最為明顯[4]。當(dāng)前市場上用于煙草根黑腐病菌防治的主要化學(xué)藥劑包括甲基托布津、甲霜靈錳鋅、福美雙、多菌靈等[5-6]。

近年來,有研究表明,某種殺菌劑的長期單一應(yīng)用可以降低防效,通過選擇作用機理不同的殺菌劑進行復(fù)配,不僅可使防效好于單一藥劑,還可以減少藥劑用量、減少對環(huán)境及煙草植株等作物的污染[7]。因此,該研究擬根據(jù)殺菌劑作用機理的不同,參考王文鳳[2]、趙永強等[3]的商品藥劑篩選試驗結(jié)果,選取7種防治煙草根黑腐病菌的常用商品化制劑開展煙草根黑腐病菌的室內(nèi)毒力測定,并在此基礎(chǔ)上選取抑制作用較好的單劑,將不同作用機制的單劑按照比例進行復(fù)配,檢驗其是否具有增效作用,以期在降低藥劑濃度的前提下,增強煙草根黑腐病的防治效果,在一定程度上降低化學(xué)藥劑對作物及環(huán)境的影響,為畢節(jié)煙區(qū)煙葉的綠色生產(chǎn)提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

煙草根黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsisbasicola),由本實驗室自貴州畢節(jié)煙區(qū)煙草根黑腐病發(fā)病田塊采集,分離并保存。

1.2 供試殺菌劑

苯丙咪唑類殺菌劑：甲基硫菌靈(甲基托布津)、多菌靈;有機硫類殺菌劑：福美雙、代森錳鋅;咪唑類殺菌劑：咪鮮胺;復(fù)配殺菌劑：甲霜·錳鋅、惡霜靈·錳鋅。供試藥劑及相關(guān)信息見表1。

表1 供試藥劑、生產(chǎn)廠家及濃度設(shè)置Table 1 Test reagent, manufacturer and concentration setting

1.3 試驗方法

1.3.1 單劑對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用測定 在PDA培養(yǎng)基上接種煙草根黑腐病菌,置于恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃)中培養(yǎng)7 d,備用。之后采用菌絲生長速率法對7種藥劑抑制病原菌生長情況進行研究。各供試藥劑先進行高濃度母液的配制(溶劑為無菌水),之后吸取一定量的母液分別與融化且冷卻到約45 ℃的15 mL PDA固體培養(yǎng)基進行混合,即可成為含有藥劑、濃度不同的PDA固體培養(yǎng)基,空白對照為加入等量無菌水的PDA培養(yǎng)基(CK)。取培養(yǎng)好的煙草根黑腐病菌PDA平板,在菌落的邊緣位置用直徑6 mm的打孔器打孔,即可獲得6 mm的菌餅。之后在含有藥劑的PDA培養(yǎng)基中央接種1個6 mm的菌種。每種藥劑處理均按照表1設(shè)置5個不同質(zhì)量濃度梯度(表1),每個濃度均設(shè)5次重復(fù),于27 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進行黑暗培養(yǎng),當(dāng)對照的菌落直徑達6 cm時,即可進行菌落直徑的測定(十字交叉法),各處理的5次重復(fù)取平均值,進行菌絲生長抑制率的計算。在此基礎(chǔ)上,利用統(tǒng)計軟件將菌絲生長抑制率換算為生物統(tǒng)計機率值(y),藥劑濃度換算成對數(shù)(x),根據(jù)濃度對數(shù)與機率值回歸法,得到線性回歸方程,由所得的回歸方程計算供試藥劑處理下煙草根黑腐病菌的相關(guān)系數(shù)和 EC50及EC90。菌絲生長抑制率的計算公式為：菌絲生長抑制率=[(對照組病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑)/對照組病原菌菌落直徑]×100%。

1.3.2 復(fù)配組合的配方篩選 根據(jù)上述7種殺菌劑的毒力測定試驗結(jié)果,參考不同單劑的作用機理[8-9],在課題組前期配比預(yù)試驗(80% 甲基硫菌靈可濕性粉劑和45%咪鮮胺水乳劑2種殺菌劑中的有效成分按照體積比9∶1、7∶3、5∶5、4∶6、2∶8配制,觀察煙草根黑腐病菌在含上述不同復(fù)配制劑的平板中的生長情況)結(jié)果基礎(chǔ)上,該研究又將80% 甲基硫菌靈可濕性粉劑和45% 咪鮮胺水乳劑2種殺菌劑中的有效成分按照體積比2∶1、1∶1、1∶2的比例復(fù)配,與融化且冷卻到約45 °C固體PDA培養(yǎng)基混合,制成0.5、1、2、4、6和8 mg/L的含藥PDA固體培養(yǎng)基,以添加等量無菌水的PDA固體培養(yǎng)基為空白對照(CK)。取培養(yǎng)好的煙草根黑腐病菌,用打孔器在菌落邊緣打孔,制成直徑6 mm的菌餅,將菌餅轉(zhuǎn)接于含毒培養(yǎng)基中央,每濃度5次重復(fù),置于生化培養(yǎng)箱中27 ℃黑暗恒溫培養(yǎng),當(dāng)空白對照菌落直徑長至約6 cm時,用十字交叉法測量菌落直徑,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。繪制標準曲線,計算不同處理組復(fù)配藥劑對煙草根黑腐病菌的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和 EC50及EC90,并根據(jù)Sun等[10]的方法計算出每組復(fù)配藥劑的共毒系數(shù)(CTC),比較不同處理組復(fù)配殺菌劑對煙草根黑腐病菌的毒力效果。其中CTC大于100時,表示復(fù)配藥劑對煙草根黑腐病菌的毒力起到增效作用,小于100時表示拮抗作用[11]。CTC的計算公式為：共毒系數(shù)(CTC)=A的EC50×B的EC50/M的EC50×(PA×B的EC50+PB×A的EC50),其中A和B分別表示2種單劑,M表示這2種單劑的混合藥劑,PA和PB分別表示A和B在混劑中的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 防治煙草根黑腐病的有效殺菌單劑的篩選

利用菌絲生長速率法,研究7種殺菌劑對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制效果,結(jié)果如表2所示。7種藥劑對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制效果明顯,其中,咪鮮胺對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用最強,當(dāng)咪鮮胺質(zhì)量濃度為0.5～6 mg/L時,其對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用最低為44.00%,最高達到68.00%;甲基硫菌靈效果次之,當(dāng)甲基硫菌靈質(zhì)量濃度為2～10 mg/L時,對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用最低為20.00%,最高達到70.40%;與此同時,代森錳鋅的抑制效果最差,當(dāng)其質(zhì)量濃度為10 mg/L時,對菌絲生長的抑制率僅為32.00%。

表2 7種藥劑對煙草根黑腐病病菌菌絲生長的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of seven fungicides on mycelial growth of Thielaviopsis basicola

通過標準曲線計算7種殺菌劑對煙草根黑腐病菌的毒力回歸方程、EC50和EC90,結(jié)果如表3所示。7種殺菌劑毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均高于0.98,說明殺菌劑濃度與對煙草根黑腐病菌的抑制效呈顯著正相關(guān),其中,咪鮮胺的EC50與EC90分別為1.63和10.99 mg/L,相對于其它殺菌劑,數(shù)值均最小,表明咪鮮胺對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制效果最好;而甲基硫菌靈的抑菌效果次之,其EC50與EC90分別為6.79和13.04 mg/L。參考7種殺菌劑對煙草根黑腐病菌的EC50和EC90,可知7種殺菌劑的有效成分對煙草根黑腐病菌的抑制作用由強到弱依次為咪鮮胺>甲基硫菌靈>福美雙>惡霜靈·錳鋅>多菌靈>甲霜·錳鋅>代森錳鋅。

表3 7種殺菌劑對煙草根黑腐病菌的毒力分析Table 3 Virulence analysis of seven fungicides against Thielaviopsis basicola

2.2 復(fù)配組合的配方篩選

上述7種殺菌劑的毒力測定試驗結(jié)果表明,咪鮮胺和甲基硫菌靈對煙草根黑腐病菌具有較好的抑制作用,其EC50和EC90值均顯著低于其他5種殺菌劑;甲基硫菌靈主要干擾病菌細胞分裂[8],咪鮮胺則是抑制病原菌細胞甾醇脫甲基化[9],二者作用機理存在差異,因此,本試驗在此基礎(chǔ)上,進一步開展甲基硫菌靈和咪鮮胺的復(fù)配試驗,以明確二者復(fù)配是否存在增效作用。試驗中,將80%甲基硫菌靈可濕性粉劑和45%咪鮮胺水乳劑2種殺菌劑中的有效成分按照體積比2∶1、1∶1、1∶2復(fù)配,對復(fù)配后得到的不同組合開展對煙草根黑腐病菌的抑菌效果研究,結(jié)果如表4所示,45% 咪鮮胺水乳劑和80% 甲基硫菌靈可濕性粉劑2種殺菌劑的有效成分分別按照1∶1和1∶2復(fù)配時,對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用均較明顯。繪制標準曲線,計算不同處理組復(fù)配殺菌劑對煙草根黑腐病菌的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50及EC90,結(jié)果顯示,45% 咪鮮胺水乳劑和80%甲基硫菌靈可濕性粉劑2種殺菌劑的有效成分1∶1復(fù)配時,對煙草根黑腐病菌的毒力較強,其EC50及EC90分別為0.19和8.39 mg/L(表5)。

表4 復(fù)配藥劑對煙草根黑腐病病菌菌絲生長的抑制效果Table 4 Inhibitory effects of compounded fungicides on mycelial growth of Thielaviopsis basicola

表5 復(fù)配藥劑對煙草根黑腐病菌的毒力測定Table 5 Virulence analysis ofcompounded fungicides against Thielaviopsis basicola

進一步計算2種殺菌劑不同復(fù)配組合的共毒系數(shù)(CTC),比較復(fù)配殺菌劑對煙草根黑腐病菌的毒力效果,結(jié)果如表5所示,45%咪鮮胺水乳劑和80%甲基硫菌靈可濕性粉劑2種殺菌劑的有效成分按照2∶1、1∶1、1∶2復(fù)配,其共毒系數(shù)分別為22.81、245.24和50.79。鑒于CTC大于100表明復(fù)配藥劑對病原菌的毒力起到增效作用,由此可知,當(dāng)咪鮮胺和甲基硫菌靈1∶1進行混配,對煙草根黑腐病菌的毒力有明顯的協(xié)同增效作用,而咪鮮胺和甲基硫菌靈按2∶1和1∶2復(fù)配時,對煙草根黑腐病菌的毒力則出現(xiàn)拮抗作用。

3 結(jié)論與討論

煙草根黑腐病作為貴州畢節(jié)煙區(qū)主要的根部病害之一[1],其發(fā)生主要受溫度、土壤pH等的影響[12-13],因此,結(jié)合煙草根黑腐病菌的侵染方式及生理特點,篩選出防治效果較好的低毒、高效殺菌劑及復(fù)配藥劑,從而為煙草根黑腐病的防治提供有效保障。該研究中,7種殺菌單劑對煙草根黑腐病菌的毒力結(jié)果表明,咪鮮胺和甲基硫菌靈對病原菌菌絲生長的抑制效果較好,明顯優(yōu)于其他殺菌劑,而代森錳鋅對病原菌生長的抑制效果最差,多菌靈以及殺毒礬抑菌效果居中。試驗結(jié)果與趙永強等[3-4]的研究報道有部分差異,趙永強等[3]發(fā)現(xiàn)甲基托布津、多菌靈、大生M-45、殺毒礬4種藥劑對煙草根黑腐病菌菌絲生長有明顯抑制作用,并根據(jù)上述4種化學(xué)藥劑作用機理,確定最佳用藥方式為多菌靈與大生M-45交替施用[4]。究其原因,可能是我國不同地區(qū)來源的煙草根黑腐病菌致病力分化明顯,并具有多樣性[14],因此,不同煙區(qū)來源的煙草根黑腐病菌可能對不同化學(xué)殺菌劑的敏感性存在差異。為了驗證此猜想,后續(xù)試驗中,課題組將廣泛采集分離貴州不同煙區(qū)的煙草根黑腐病菌,對其生理特征、致病力差異以及對化學(xué)殺菌劑的敏感程度進行深入研究。

本研究中,45%咪鮮胺水乳劑和80%甲基硫菌靈可濕性粉劑2種殺菌劑的有效成分按1∶1進行混配,對煙草根黑腐病菌的毒力有明顯的協(xié)同增效作用。究其原因,可能是甲基硫菌靈屬于苯并咪唑類內(nèi)吸式殺菌劑,其可以干擾病菌有絲分裂中紡錘體的形成,從而影響細胞分裂,對多種病害有預(yù)防和治療作用[8];而咪鮮胺作為一種廣譜性內(nèi)吸式殺菌劑,可抑制病原菌細胞甾醇脫甲基化[9],二者作用機理不同,因此,結(jié)合2種殺菌劑不同防治作用機制,將二者進行復(fù)配,可達到增效、延緩抗藥性的作用。

該試驗中,課題組通過室內(nèi)毒力測定研究了不同化學(xué)殺菌劑以及復(fù)配制劑對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用,而化學(xué)藥劑對根黑腐病菌孢子是否具有抑制作用尚不清楚,因此,后續(xù)試驗中將利用該試驗獲得的復(fù)配化學(xué)制劑開展對根黑腐病菌孢子萌發(fā)的抑制試驗,以期初步了解復(fù)配制劑對煙草根黑腐病菌的抑菌機制。此外,由于藥劑的作用效果在田間受到溫度、濕度等環(huán)境條件的影響,室內(nèi)測定結(jié)果與田間施用效果可能會有一定的偏差,因此,復(fù)配藥劑的防控效果還需要通過進一步的盆栽以及田間試驗來驗證。

綜上,室內(nèi)殺菌劑毒力測定結(jié)果表明,咪鮮胺、甲基硫菌靈2種殺菌劑對煙草根黑腐病菌均具有較強的抑制作用;且咪鮮胺和甲基硫菌靈1∶1復(fù)配時,對煙草根黑腐病菌的毒力有明顯的協(xié)同增效作用,EC50為0.19 mg/L。