馬盼盼,康啟超,陳雪,王興,田芯瑗,郝勝菊,惠玲,徐福蓉,張釧

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type1,NF1,OMIM: 162200)是一種由NF1基因突變導致的常染色體顯性遺傳病,成年先證者該病完全外顯[1]。NF1通過影響來源于胚胎神經(jīng)鞘的組織而導致多種臨床表現(xiàn)[2]。該病主要臨床表現(xiàn)包括牛奶咖啡斑、皮膚及皮下神經(jīng)纖維瘤、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤,其他不常見的臨床表現(xiàn)包括學習障礙和骨骼系統(tǒng)異常(如:脊柱側(cè)彎)等,并且其臨床表型隨著年齡的增加而增多和加重[3]。NF1的發(fā)病率約為1∶3 500,自發(fā)突變率為50%左右[4]。本文報告1例家族遺傳性NF1患者,通過全外顯子測序?qū)υ摶颊哌M行基因變異分析,對可疑變異位點進行Sanger測序驗證,明確其致病基因變異位點,探討其致病原因。

1 資料與方法

1.1臨床資料 先證者來自于甘肅省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心。先證者男,33歲,自述10歲左右自己發(fā)現(xiàn)皮膚上有咖啡斑,近3年來出現(xiàn)手腳麻木、無力、脖子不能扭轉(zhuǎn),不能從事體力勞動。查體:胸前及腰間有多個牛奶咖啡斑(圖1a),身體多處發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤,先證者通過脊椎手術(shù)進行了部分神經(jīng)纖維瘤的切除,癥狀有所緩解,脖子可以轉(zhuǎn)動。診斷:NF1。先證者父親也有多個牛奶咖啡斑,出現(xiàn)時間不詳,背部有多個神經(jīng)纖維瘤突起(圖1b)。先證者妻子未發(fā)現(xiàn)牛奶咖啡斑,先證者與妻子結(jié)婚9年未自然懷孕,輔助生殖生育雙胞胎男孩,現(xiàn)4歲,均有牛奶咖啡斑(圖1c～1d)。該患者有家族史,家系圖見圖2。

1.2標本采集及基因組DNA提取 經(jīng)先證者及其家屬知情并簽署基因檢測知情同意書。分別抽取先證者及其家系外周靜脈血各2～3 mL,EDTA抗凝。使用天根DNA提取試劑盒提取標本DNA,NanoDrop2000測定DNA的濃度均在50 ng/μL左右,OD260/280在1.8～2.0之間。本研究經(jīng)本院倫理委員會([2021]GSFY倫審[65]號)批準。

1.3目標序列捕獲、高通量測序及生物信息學分析

1.3.1樣本基因組DNA片段化、末端修復及3′加“A” 利用酶切的方式將基因組DNA打斷為200 bp左右的小片段DNA,末端修復和3′加“A”。

1.3.2接頭連接及加標簽 利用標準文庫建庫試劑盒對小片段DNA段進行Adapter接頭連接,再加入Index標簽,并通過Qubit 3.0 Fluorometer和Agilent 2100 Bioanalyzer system進行文庫質(zhì)檢。

1.3.3目標區(qū)域捕獲和高通量測序 生物素特異標記的探針與文庫DNA進行雜交,鏈霉親和素修飾的捕獲磁珠捕獲目的基因。采用Illumina Next Seq CN500測序儀進行測序。

1.3.4數(shù)據(jù)篩選與生物信息學分析 應用分析平臺(北京邁基諾公司)進行致病基因篩選。應用ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)及人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database,HGMD)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)分析該位點變異。

1.4Sanger驗證 使用在線Primer 3.0(http://primer3.ut.ee)軟件設(shè)計引物,擴增引物序列:F 5′-GCAACAGAGGAAGACACCAT-3′,R:5′-CACAGTTTGACACAGGCAAT-3′。對候選致病基因NF1變異位點區(qū)域進行PCR擴增,Sanger測序驗證。測序結(jié)果與NF1基因參考序列(NM_000267)進行序列比對。

2 結(jié)果

2.1全外顯子基因檢測結(jié)果 經(jīng)全外顯子測序數(shù)據(jù)分析,篩選到與先證者臨床表型相關(guān)的變異:NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點雜合變異,該變異位于NF1基因內(nèi)含子8上,即剪接位點第c.889-2_889-1位插入6個堿基TTTCTG,可能導致外顯子的跳躍或內(nèi)含子的滯留。

2.2Sanger測序驗證結(jié)果 應用Sanger測序?qū)ο茸C者全外顯子組測序結(jié)果進行驗證。Sanger測序結(jié)果與全外顯子組測序結(jié)果一致,先證者NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點雜合變異。同時對家系其他成員進行該位點Sanger測序,結(jié)果提示先證者父親及其兩個雙胞胎兒子均存在NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點雜合變異,先證者之妻未見該位點變異(圖3)。

圖3 先證者家系NF1基因變異位點Sanger測序圖(紅色箭頭示變異位點)

2.3致病性分析結(jié)果 根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)2015年指南[5]對該變異位點進行致病性分析,c.889-2_889-1insTTTCTG變異為NF1基因剪接位點插入突變,該變異導致基因功能可能喪失,為超強致病證據(jù)(PVS1);在正常人群數(shù)據(jù)庫中該變異頻率小于0.000 5,為低頻變異,為中等致病證據(jù)(PM2);該突變相關(guān)的疾病與先證者臨床表型高度吻合,為支持證據(jù)(PP4)。因此該變異評級為致病性變異。文獻數(shù)據(jù)庫未有該位點的相關(guān)性報道,ClinVar及HGMD數(shù)據(jù)庫均未收錄該位點。

3 討論

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病是由腫瘤抑制基因(NF1基因) 突變導致的。NF1基因位于17q11.2,全長350 kb。NF1基因的表達產(chǎn)物為神經(jīng)纖維蛋白,由2 818個氨基酸組成,有抑制腫瘤的作用[6]。HGMD已報道的NF1突變類型目前已超過3 000種,突變類型包括缺失/插入突變、錯義突變、無義突變、剪接突變、復雜重排等,尚未發(fā)現(xiàn)明確的突變熱點。NF1的診斷主要依據(jù)1988年美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)制定的Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的診斷標準。包括:①6個及以上的牛奶咖啡斑,青春期前直徑大于5 mm,青春期后直徑大于15 mm;②2個及以上任何類型的神經(jīng)纖維瘤,或1個叢狀神經(jīng)纖維瘤;③腋窩或腹股溝雀斑;④視神經(jīng)膠質(zhì)瘤;⑤2個及以上虹膜錯構(gòu)瘤(Lisch 結(jié)節(jié));⑥骨損害,如蝶骨翼發(fā)育不良,長骨皮質(zhì)細線化,有或無假關(guān)節(jié);⑦一級親屬關(guān)系中有符合上述標準的NF1。以上標準符合2條即可確診NF1[7]。

本家系中先證者臨床表型根據(jù)NF1診斷標準可以臨床診斷為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病。但是在先證者未行基因檢測的情況下,即進行輔助生殖,導致出生的雙胞胎兒子也同樣為NF1患者。因此,在做人工輔助生育之前,臨床醫(yī)生應仔細詢問患者病史并進行相應的體格、皮膚檢查;有臨床遺傳病家族史的夫妻做人工輔助生育之前應該先做相關(guān)基因檢測。明確診斷后,再通過輔助生殖技術(shù)、胚胎植入前基因診斷和孕中期產(chǎn)前單基因病診斷技術(shù)來阻斷遺傳病患兒的出生。

NF1可出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn),除常見的表型之外,文獻報道NF1患者也有皮膚麻木、肢體麻木、乏力的表型[8],研究發(fā)現(xiàn),剪切位點突變常與脊髓腫瘤相關(guān)[9]。本文對先證者全外顯子進行檢測,發(fā)現(xiàn)NF1基因8號內(nèi)含子剪接位點雜合性插入突變c.889-2_889-1insTTTCTG,根據(jù)ACMG指南評級為致病性變異。Sanger測序檢測到先證者、先證者父親和先證者的雙胞胎兒子均存在該位點雜合變異,先證者妻子未發(fā)現(xiàn)該變異。根據(jù)臨床表型、基因檢測結(jié)果和家系調(diào)查可以診斷此家系患者為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病,致病基因突變?yōu)镹F1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點。

剪接突變是人類遺傳病突變類型中常見的一種,其導致的結(jié)果有外顯子的跳躍、內(nèi)含子的滯留等。在哺乳動物基因組中,剪接位點為經(jīng)典GT-AG組合的概率為98.71%[10-11]。正常情況下NF1基因c.889-5_895位點序列為tgtagAAGTTAT(小寫為內(nèi)含子,大寫為外顯子),發(fā)生突變后此段序列為tgtaTTTCTGgAAGTTAT(小寫為內(nèi)含子,大寫為外顯子,下劃線標出為插入序列)。正常情況下剪接發(fā)生于c.889-2_889-1AG,9號外顯子從c.889_890AA開始編碼氨基酸。突變發(fā)生以后剪接只能發(fā)生于后面的c.890_891AG,9號外顯子從c.892_893TT開始編碼氨基酸,導致閱讀框移位。由于實驗條件限制,本研究尚未對NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點進行剪接影響分析,因此該突變對NF1基因mRNA剪接的影響還需進一步的研究。

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的表型多種多樣,一個家系中同樣的突變會有不同的表型。雖然具體表現(xiàn)、進展速度和并發(fā)癥的嚴重程度差別很大,但病情在個體一生中是逐漸進展的[12]。目前沒有有效的治療方法,臨床治療通常局限于監(jiān)測和對癥治療,通常是手術(shù)治療特定的并發(fā)癥[13]。本家系中4人攜帶NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點突變,但是他們的臨床表型輕重不一。先證者除了有明顯的牛奶咖啡斑之外,全身多處有神經(jīng)纖維瘤,進行手術(shù)部分切除。但是文獻報道神經(jīng)纖維瘤不易徹底剔除,容易復發(fā),應定期檢查[14]。相比較之下,先證者父親也有多處牛奶咖啡斑,背部有神經(jīng)纖維瘤狀突起,但沒有明顯的神經(jīng)癥狀?？赡苁且驗樯窠?jīng)纖維瘤長在不同部位影響不同部位的功能,從而表現(xiàn)出不同的表型,也有可能是常染色體顯性遺傳病所有的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象導致的。先證者兩個雙胞胎兒子目前只是有牛奶咖啡斑,沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤,可能是年齡尚小未表現(xiàn)出,應定期體檢、隨訪。

總之,本研究對1例遺傳性Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病患者及其家系進行了表型和基因型的研究。NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點雜合變異為該家系的致病原因,且該位點為未見報道的新發(fā)變異,擴充了NF1基因突變譜,為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病患者的診斷提供了依據(jù)。對于輔助生殖的夫婦,一定要進行詳細的病史問詢和體格檢查來判斷是否有遺傳病存在的可能,如果存在遺傳病需明確診斷后再進行輔助生殖,通過胚胎植入前基因診斷和孕中期產(chǎn)前基因病診斷技術(shù)來阻止患兒的出生。