胡珊，張文锍，孫勇兵，雷銘道，胡律江

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.江西省婦幼保健院藥學(xué)科，江西 南昌 330006）

在胃腸道上皮細(xì)胞中表達(dá)著很多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物和食物消化吸收進(jìn)入血液循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在這些眾多的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Peptide transporter 1，PEPT1）是目前藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中研究最深入和應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的主要功能是介導(dǎo)二肽、三肽和一些擬肽類藥物的口服攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要表達(dá)在各種組織細(xì)胞膜上，所以影響著藥物的吸收、分布，在藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為中起著關(guān)鍵作用[2]。通常把寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白劃分定位在上皮細(xì)胞刷狀緣側(cè)和定位在上皮細(xì)胞基底側(cè)膜的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩類，在這兩類寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)同作用下寡肽和擬肽類藥物完成了由腔道側(cè)向血液側(cè)完整的跨上皮細(xì)胞吸收過(guò)程。

PEPT1主要分布于小腸上皮細(xì)胞，此外，在眼部血液-房水屏障和血液-視網(wǎng)膜屏障、肝外上膽管皮細(xì)胞頂膜、腎臟近端小管處亦有少量的PEPT1 表達(dá)。20 世紀(jì)90 年代中期，PEPT1 和PEPT2（基因代碼分別為SLC15A1和SLC15A2）這兩種頂側(cè)膜的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被鑒定出來(lái)，PEPT2 主要表達(dá)在腎臟上皮細(xì)胞的頂側(cè)膜端。但是基底膜的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白目前仍未被克隆出來(lái)。本文綜述了有關(guān)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PEPT1 的最新研究進(jìn)展，以期為后續(xù)對(duì)PEPT1的研究提供思路和參考。

1 PEPT1的生物學(xué)特征和底物結(jié)構(gòu)分析

1.1 PEPT1的生物學(xué)特征

1994 年，F(xiàn)ei 從兔小腸中首次克隆了PEPT1，1995年人小腸寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hPEPT1）也被成功克隆。hPEPT1（基因代碼為SLC15A1）含有708 個(gè)氨基酸殘基，在小腸有豐富的表達(dá)，并定位于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣側(cè)，在小腸近端到遠(yuǎn)端方向上表達(dá)水平漸增。人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最重要的亞型PEPT2 在小腸內(nèi)沒(méi)有表達(dá)，主要表達(dá)在腎臟細(xì)胞，重吸收尿液中的寡肽和擬肽類藥物進(jìn)入血液循環(huán)。PEPT1 使用細(xì)胞內(nèi)外H+濃度梯度差和負(fù)的膜電位作為轉(zhuǎn)運(yùn)底物的能量來(lái)源。2011年，牛津大學(xué)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Newstead 教授首次解析了來(lái)源于希瓦氏菌（Shewanelle oneidensis）PEPTSo 的三維晶體結(jié)構(gòu)[3]，并且發(fā)現(xiàn)PEPT1 采用交替通路模式（Alternating access）轉(zhuǎn)運(yùn)底物，這大大提高了對(duì)PEPT1功能和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的認(rèn)識(shí)[4-6]。PEPT1 屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)超家族（major facilitator family，MFS）。

1.2 PEPT1的底物結(jié)構(gòu)分析

肽鍵一般被認(rèn)為是PEPT1 識(shí)別底物的重要官能團(tuán)。但實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)，肽鍵、氨基和羧基并不都是PEPT1 識(shí)別底物所必需的[7-8]，如5-氨基乙酰丙酸沒(méi)有肽鍵，頭孢克肟（cefixime）沒(méi)有氨基端，伐昔洛韋沒(méi)有肽鍵和羧基端[9]，但是它們都能被PEPT1 識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)，只是底物如果沒(méi)有肽鍵、氨基和羧基這些基團(tuán)，它們與PEPT1 的親和力可能會(huì)降低[10]；具有氨基端的氨基青霉素和氨基頭孢菌類與PEPT1 有很高的親和力，這兩個(gè)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率和口服生物利用度都很高[11]。一般來(lái)說(shuō)，與三肽相比，由2 個(gè)L-氨基酸組成的二肽與PEPT1 之間的親和力（affinity）更好，N-端或C-端取代基的體積大小和底物大小對(duì)PEPT1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)也有顯著影響[12]。具有疏水性側(cè)鏈的寡肽顯示出與PEPT1更高的親和力。

PEPT1屬于低親和力、高轉(zhuǎn)運(yùn)能力的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，即米氏常數(shù)Km 和Vm 都比較大，這非常有利于PEPT1對(duì)底物的腸吸收，因?yàn)槟c道內(nèi)高濃度的底物不易將轉(zhuǎn)運(yùn)能力達(dá)到飽和。PEPT1的底物非常廣泛，包括二肽、三肽化合物和一些擬肽類藥物（peptidomimetics）。β-內(nèi)酰胺類抗生素如頭孢羥氨芐、阿莫西林，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑如福辛普利、依那普利，多巴胺受體抑制劑，腎素抑制劑，抗腫瘤藥物或抗病毒藥物如貝他定、伐昔洛韋等都是PEPT1的底物。

PEPT1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)具有明顯的立體選擇性。在結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽過(guò)程中，PEPT1 對(duì)含有L-氨基酸殘基的寡肽比含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸殘基的寡肽具有較高的親和力。阿昔洛韋、阿糖胞苷、地西他濱等藥物的L-纈氨酸前藥與PEPT1 的親和力明顯高于相應(yīng)的D-纈氨酸。

2 PEPT1的三維蛋白結(jié)構(gòu)分析

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，PEPT1 和PEPT2 的蛋白晶體結(jié)構(gòu)逐漸被解析出來(lái)，這大大促進(jìn)了對(duì)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。來(lái)源于希瓦氏菌（Shewanelle oneidensis）PEPTSo的三維晶體結(jié)構(gòu)于2011 年被解析出來(lái)（圖1）[3]，其后很多不同來(lái)源的PEPT的三維空間結(jié)構(gòu)被解析，這些三維結(jié)構(gòu)都是蛋白和底物（ligand）結(jié)合在一起的狀態(tài)下測(cè)定的，如表1 所示。2021 年，人PEPT2 的三維晶體結(jié)構(gòu)被解析出來(lái)，但到目前為止人PEPT1 的三維晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析出來(lái)。通過(guò)對(duì)PEPT1 三維晶體結(jié)構(gòu)的分析，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)手段，可以設(shè)計(jì)更好的底物分子來(lái)提高一些難吸收藥物的口服生物利用度。

圖1 PEPTSo的三維晶體結(jié)構(gòu)［3］Figure1 Three-dimensional crystal structure of PEPTSO

表1 已經(jīng)報(bào)道的POT家族寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)Table1 The crystal structure of the reported POT family oligopeptide transporters

三維晶體研究發(fā)現(xiàn)，PEPT1 由分別折疊成N-和C-兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的12 次跨膜螺旋（Transmembrane helices）組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有6 個(gè)跨膜螺旋，即TM1～6 組成N-結(jié)構(gòu)域（N-hundle），TM7～12 組成C-結(jié)構(gòu)域（Nhundle，圖1）。底物結(jié)合口袋（substrate-binding cavity）位于N-結(jié)構(gòu)域和C-結(jié)構(gòu)域之間，處于整個(gè)蛋白靠近中心的位置。PEPT1 采取交替通路模式進(jìn)行底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，在一個(gè)完整的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)經(jīng)歷4 種構(gòu)象的變化，即開(kāi)口向外（outward open）、填充態(tài)（latteral occluded）、開(kāi)口向內(nèi)（inward open）和豎直填充（verti‐cal occluded），最終將底物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部（圖2）[3]。

圖2 PEPT1的交替通路模式[3]Figure 2 The alternate path for PEPT1

3 以PEPT1為靶點(diǎn)的前體藥物設(shè)計(jì)

口服給藥由于給藥方便，病人的順應(yīng)性高，因此最受患者的歡迎，也是目前最主要的給藥途徑，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家最暢銷的50 種藥品中84%是口服制劑。但是口服給藥的開(kāi)發(fā)受到越來(lái)越大的挑戰(zhàn)。現(xiàn)代組合化學(xué)和高通量篩選技術(shù)的結(jié)合雖然發(fā)現(xiàn)了很多新的具有很好藥理活性的先導(dǎo)化合物（new chemical entity，NCE），但是早期對(duì)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)的忽略，可能會(huì)出現(xiàn)口服生物利用度低且差異大的現(xiàn)象，使得最終藥物分子并不適合口服這種便捷的給藥形式。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，藥物研究中有40%的候選藥物是由于藥動(dòng)學(xué)參數(shù)不佳導(dǎo)致體內(nèi)無(wú)活性而遭到淘汰。因此，有必要改善藥物的口服生物利用度，以提高新藥開(kāi)發(fā)的成功率并滿足臨床要求。

由于PEPT1 對(duì)底物結(jié)構(gòu)的高耐受性和底物識(shí)別的多專屬性可以識(shí)別廣泛范圍內(nèi)的不同大小、疏水性和荷電的藥物分子，使得以PEPT1 為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)載體前藥提高藥物吸收成為一種非常具有前景的策略。一個(gè)常規(guī)的途徑就是將PEPT1 識(shí)別基團(tuán)（如氨基酸或者二肽）和母體藥物通過(guò)化學(xué)鍵連接在一起，使之成為能夠被PEPT1識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)的前藥[26]。

3.1 二肽類前藥（Dipeptide-like prodrug）

擬二肽類前藥通常是在母藥的結(jié)構(gòu)上接上1 個(gè)PEPT1 識(shí)別基團(tuán)。多巴（L-dopa）是一種治療帕金森的藥物，但由于首過(guò)效應(yīng)和低的小腸膜滲透率，口服生物利用度僅30%。Tamai 等[27]將L-dopa 的羧基與L-苯丙氨酸的氨基通過(guò)酰胺鍵相連，形成前藥L-dopa-L-Phe，Caco-2 細(xì)胞為模型研究發(fā)現(xiàn)，L-dopa-L-Phe 在PEPT1的介導(dǎo)下，膜滲透性是L-dopa 的40 倍。L-α-甲基多巴用于高血壓的治療，但α-甲基的存在嚴(yán)重降低了L-α-甲基多巴和PEPT1 的親和性，使得α-甲基多巴口服難吸收。Hu等[28]合成了前藥L-α-甲基多巴-L-苯丙氨酸。與其母藥相比，L-α-甲基多巴-L-苯丙氨酸在PEPT1 的介導(dǎo)下，小腸的膜滲透率比母藥提高了近20 倍。Wang 等[29]制備了L-α-甲基多巴的另一種二肽衍生物D-苯甘氨酸-L-α-甲基多巴。兔空腸在體單灌流實(shí)驗(yàn)表明，前藥小腸滲透率是母藥的3.5 倍，而明顯小于L-苯甘氨酸-L-α-甲基多巴。

帕拉米韋是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，它的結(jié)構(gòu)中含有胍基、羧基和羥基，使其小腸膜滲透性差，口服生物利用度約為5%左右。孫勇兵等[30]合成了系列帕拉米韋的氨基酸酯類前藥和酰胺類前藥，其中L-纈氨酸酯和L-異亮氨酸酰胺前藥都能大幅度提高帕拉米韋的口服生物利用度，利用高度表達(dá)PEPT1 的細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，L-纈氨酸酯和L-異亮氨酸酰胺前藥都是PEPT1 的底物，它們的膜滲透性分別是帕拉米韋的10.9 和9.1倍。孫勇兵等[31]開(kāi)發(fā)的阿糖胞苷-L-纈氨酸酯鹽酸鹽能將阿糖胞苷的口服生物利用度由21.6%提高至60%，研究表明，阿糖胞苷-L-纈氨酸酯鹽酸鹽是PEPT1的底物，該前藥已經(jīng)于2016年11月獲得了國(guó)家藥監(jiān)局簽發(fā)的1.1類新藥的臨床研究批件。

地西他濱是一種用于治療骨髓增生異常綜合征等疾病DNA去甲基化抑制劑，但其膜滲透性差且在體內(nèi)極易水解，生物利用度只有9%。Zhang 等[32]通過(guò)在地西他濱上引入不同氨基酸如色氨酸、異亮氨酸、酰胺酸等，合成了一系列以PEPT1 為底物的地西他濱氨基酸衍生化類前藥。其中L-苯丙氨酸酯前藥（5′-O-Lphenylanlany-dac）和L-纈氨酸酯前藥（5′-O-L-Vanlal-dac）的膜滲透性分別是地西他濱的3.75倍和3.28倍。大鼠藥物代謝動(dòng)力學(xué)表示，L-苯丙氨酸酯和L-纈氨酸酯兩個(gè)前藥口服生物利用度分別提高了30%和20%。

3.2 三肽類前藥（Tripeptide-like prodrug）

一系列研究表明，將藥物設(shè)計(jì)成三肽，在PEPT1的介導(dǎo)下，可大大提高其口服生物利用度。在藥物分子中連上1 個(gè)二肽分子，即三肽類似物，使它成為PEPT1 底物。與二肽類似物相比，三肽類似物具有更高的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性[33]。Erza等[34]在帕米磷酸鈉（pamidronate）和阿侖磷酸鈉（alendronate）的分子結(jié)構(gòu)上接上脯氨酰苯丙氨酸二肽，前藥的小腸吸收都比母藥提高了3 倍，Caco-2 細(xì)胞頂側(cè)到底側(cè)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)也有很大程度地提高。

阿昔洛韋常用于治療最初和復(fù)發(fā)的單純性黏膜皰疹，通常會(huì)引起角膜混亂，由于血眼屏障限制了親水性藥物進(jìn)入眼內(nèi)組織，因此可以優(yōu)選具有高滲透性和優(yōu)異酶穩(wěn)定性的前藥。就阿昔洛韋而言，Gly-Val-ACV 比Val-ACV增加了約2倍的利用度，表明阿昔洛韋的二肽酯前藥比氨基酸酯前藥具有更高的全身利用度[35]。

奇多夫定是抗病毒藥物，為提高其穩(wěn)定性，周潔等[36]對(duì)奇多夫定進(jìn)行修飾，在其母藥上連接二肽，合成了一些列dipeptide-AZT 化合物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它與頭孢氨芐之間存在著較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，證明二肽修飾AZT 化合物也是PEPT1 的底物之一，dipetide-AZT 化合物相比于AZT 具有不同的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效果以及細(xì)胞毒性。

當(dāng)前，PEPT1 靶向前藥面臨的重要問(wèn)題是前藥的化學(xué)和降解穩(wěn)定性，很多前藥在被腸上皮細(xì)胞識(shí)別之前已經(jīng)降解了[37]。這就是目前PEPT1 靶向藥物設(shè)計(jì)存在的主要挑戰(zhàn)[38]，主要原因是以PEPT1 為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)，絕大多數(shù)是利用酯鍵將藥物和氨基酸相連，由于胃腸道中存在大量酯酶，前藥的酯鍵在胃腸道中是不穩(wěn)定的。酯鍵的快速降解會(huì)導(dǎo)致前藥不能最大幅度地提高母藥的口服生物利用度，更嚴(yán)重的還會(huì)引起由前藥降解而生成的母藥在胃腸道局部聚集而導(dǎo)致的副作用。英國(guó)Idenix 公司開(kāi)發(fā)的抗病毒藥物NM283（Valopicitabine）是2′-C-Methylcytidine 的纈氨酸酯，能夠在PEPT1 的介導(dǎo)下將母藥的生物利用度提高至34%[39]，但是在二期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)劑量提高至800 mg/d 時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應(yīng)，臨床研究被迫終止。研究發(fā)現(xiàn)，NM283 結(jié)構(gòu)中酯鍵在腸道的不穩(wěn)定性是生物利用度提高幅度較低（僅34%）和嚴(yán)重的胃腸副作用的主要原因[40]。美國(guó)密歇根大學(xué)的Smith DE 教授研究發(fā)現(xiàn)，雖然吉西他濱的L-纈氨酸前藥5′-L-valyl-gemcitabine 與PEPT1 的親和性很高，但是口服5′-L-valyl-gemcitabine后吉西他濱的生物利用度為10%，和口服吉西他濱是一樣，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，是因?yàn)?′-L-valyl-gemcitabine在被小腸吸收之前已經(jīng)完全降解了[41]。

因此，提高母藥與PEPT1 的親和性、前藥的胃腸道穩(wěn)定性和前藥在體內(nèi)的代謝激活之間必須取得平衡，也是目前以PEPT1 為靶點(diǎn)的前藥設(shè)計(jì)面臨的重要課題。

4 總結(jié)

PEPT1 在小腸上皮細(xì)胞刷狀緣側(cè)有豐富的表達(dá)，在一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物的口服吸收中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用，由于PEPT1廣泛的底物專屬性，PEPT1已經(jīng)是通過(guò)前藥途徑提高難吸收藥物口服生物利用度的重要途徑。本文綜述了PEPT1 在組織和細(xì)胞中的表達(dá)和分布、三維晶體結(jié)構(gòu)和在前藥設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。采用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白靶向的前藥策略來(lái)改善母藥的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，尤其是PEPT1 靶向的前藥，是一條快速有效的新藥創(chuàng)制手段。PEPT1在前藥設(shè)計(jì)中有效的解決了許多母藥存在著穩(wěn)定性差、生物利用度不高、膜滲透差等問(wèn)題，但如何避免前藥中酯鍵的快速降解會(huì)導(dǎo)致前藥不能最大幅度的提高母藥的口服生物利用度是目前仍需探索的問(wèn)題。