高偉 李慧穎 李丹

缺血性心臟病是常見的心血管疾病,它可導(dǎo)致心肌缺血缺氧,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[1]。心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是缺血性心臟病的常見臨床和病理狀態(tài),尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)后。心肌I/R損傷是AMI治療失敗和病情惡化的主要原因之一[2]。普拉克索是一種選擇性多巴胺D2受體激動劑,具有多巴胺能活性、抗氧化活性和神經(jīng)保護(hù)作用[3]。先前的研究表明,普拉克索對心肌I/R損傷具有保護(hù)作用,其通過促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬和活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,改善缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率,降低乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性[4],然而,作用機(jī)制尚未完全明確。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一種促氧化蛋白,對硫氧還蛋白的活性及其抗氧化功能具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[5]。已有研究表明,心臟特異性TXNIP過表達(dá)通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心肌I/R損傷小鼠心功能不全,而心臟特異性TXNIP基因敲除則會減輕I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,改善心功能[6]。另有研究表明,敲低TXNIP通過抑制p38和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinse,JNK)磷酸化減輕氧糖剝奪所致的神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,從而在缺血性卒中中發(fā)揮保護(hù)作用[7]。本研究旨在探究普拉克索對氧糖剝奪/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)心肌細(xì)胞的作用及機(jī)制是否與TXNIP和p38/JNK通路相關(guān),以期為明確普拉克索在心肌I/R損傷中的藥理作用機(jī)制及開發(fā)新的心肌I/R損傷治療藥物提供新的科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;普拉克索購自美國MedChemExpress;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國ThermoFisher Scientific;TXNIP 過表達(dá)載體(oe-TXNIP)及其陰性對照(oe-NC)購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司;CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(比色法)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)測定試劑盒(免疫抑制法)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)和總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1 法)購自南京建成生物工程研究所;Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;TXNIP和GAPDH抗體購自英國Abcam公司;p-p38、p38、p-JNK和JNK抗體購自美國Cell Signaling Technology;AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及OGD/R處理 H9c2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),條件為37℃、5%CO2和95%空氣。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),胰酶液消化細(xì)胞,按照需求進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者是鋪板操作。參考文獻(xiàn)[8],對H9c2細(xì)胞進(jìn)行OGD/R處理。首先將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基,隨后將細(xì)胞置于37℃、94% N2、5% CO2、1%O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)6 h。收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 普拉克索使用濃度檢測 將對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞接種于96孔板,每孔1×104個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為0 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組、80 μmol/L組、100 μmol/L組、120 μmol/L組和140 μmol/L組,按照分組,向細(xì)胞中添加不同濃度普拉克索。另設(shè)空白組(無細(xì)胞和試劑)用以讀值調(diào)零。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,按照CCK-8試劑盒說明書所示檢測各組細(xì)胞光密度(OD)值。細(xì)胞活力(%)=(給藥組OD值-空白組OD值)/(0 μmol/L組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 細(xì)胞分組及給藥處理 取對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞接種于6孔板,每孔1×106個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、OGD/R組、Pra-50 μmol/L組(添加普拉克索50 μmol/L)和Pra-100 μmol/L組(添加普拉克索100 μmol/L),按照分組,添加普拉克索,而對照組和OGD/R組添加等量溶劑。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,除對照組外,其余組均進(jìn)行OGD/R處理。收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞接種于6孔板,1×106個(gè)/孔。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為OGD/R組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作)、Pra-100 μmol/L組(添加100 μmol/L普拉克索但不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作)、Pra-100 μmol/L+oe-NC組(添加100 μmol/L 普拉克索并轉(zhuǎn)染oe-NC)和Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP組(添加100 μmol/L普拉克索并轉(zhuǎn)染oe-TXNIP)。按照分組,根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。添加普拉克索處理細(xì)胞24 h后,對各組細(xì)胞進(jìn)行OGD/R處理。收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.6 CCK-8檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞接種于96孔板,每孔1×104個(gè)細(xì)胞。按照1.4和1.5所示對細(xì)胞進(jìn)行分組和處理。此外,另設(shè)空白組(無細(xì)胞和試劑)用以讀值調(diào)零。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書所示檢測各組細(xì)胞光密度(OD)值。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%或者是細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(OGD/R組OD值-空白組OD值)×100%。

1.7 試劑盒檢測LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量 收集H9c2細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明書所示檢測細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS產(chǎn)生 棄去H9c2細(xì)胞培養(yǎng)上清液,PBS清洗后,向細(xì)胞中加入濃度為10 μmol/L的DCFH-DA工作液,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min后,用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞后,收集細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測ROS產(chǎn)生。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集H9c2細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞后重新收集細(xì)胞。向細(xì)胞中加入1×結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml。取100 μl 細(xì)胞懸液,向細(xì)胞中添加5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液,輕輕混勻,室溫條件下避光孵育15 min。加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液,充分混勻后,立即用流式細(xì)胞儀檢測。

1.10 Western blot檢測TXNIP、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白表達(dá) 收集H9c2細(xì)胞,裂解液裂解細(xì)胞。收集上清液并測定其蛋白濃度。各組取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳以及轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫條件下封閉3 h,加入TXNIP(1∶1 000)、p-p38(1∶2 000)、p38(1∶1 000)、p-JNK(1∶2 000)、JNK(1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體,4℃條件下孵育過夜。加入二抗(1∶5 000),室溫條件下孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶,Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.11 qRT-PCR檢測TXNIP mRNA表達(dá) 收集H9c2細(xì)胞,Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書所示,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)程序:95℃、5 min;95℃、10 s,60℃、30 s,40個(gè)循環(huán);95℃、15 s,60℃、60 s,95℃、15 s。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算TXNIP mRNA表達(dá)。TXNIP上游引物:5’-AAGCGT

TGAGTAGTACAGATGAG-3’; TXNIP下游引物:5’-GGTATGGCGTGGCAAGAGTC-3’;GAPDH上游引物:5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’; GAPDH下游引物:5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’。

2 結(jié)果

2.1 普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激和凋亡的影響

2.1.1 與0 μmol/L組比較,120 μmol/L組和140 μmol/L組心肌細(xì)胞活力降低(P<0.05),而20 μmol/L組、40 μmol/L組、80 μmol/L組和100 μmol/L組心肌細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中普拉克索的最大安全濃度為100 μmol/L。見表1。

表1 CCK-8檢測不同濃度普拉克索處理下的細(xì)胞活力 %,

2.1.2 與對照組比較,OGD/R組心肌細(xì)胞活力降低,心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與OGD/R組相比,Pra-50 μmol/L組和Pra-100 μmol/L組心肌細(xì)胞活力升高,心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈劑量依賴性。見表2,圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS產(chǎn)生和心肌細(xì)胞凋亡;A 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS產(chǎn)生;B流式細(xì)胞術(shù)檢測普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞凋亡的影響

表2 普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞損傷的影響 %,

2.2 普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)和p38/JNK通路的影響 與對照組相比,OGD/R組心肌細(xì)胞TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與OGD/R組相比,Pra-50 μmol/L組和Pra-100 μmol/L組心肌細(xì)胞TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈劑量依賴性。見表3,圖2。

圖2 Western blot檢測普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)和p38/JNK通路的影響

表3 Western blot檢測普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)和p38/JNK通路的影響

2.3 過表達(dá)TXNIP逆轉(zhuǎn)普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與OGD/R組相比,Pra-100 μmol/L組心肌細(xì)胞中TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05),細(xì)胞活力升高,心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與Pra-100 μmol/L組相比,Pra-100 μmol/L+oe-NC組心肌細(xì)胞中TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Pra-100 μmol/L+oe-NC組相比,Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP組心肌細(xì)胞中TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.05),細(xì)胞活力降低,心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表4、5,圖3、4。

圖3 過表達(dá)TXNIP逆轉(zhuǎn)普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響;A 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS產(chǎn)生;B 流式細(xì)胞術(shù)檢測普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖4 Western blot檢測細(xì)胞中TXNIP蛋白表達(dá)

表4 Western blot檢測普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)和p38/JNK通路的影響

表5 過表達(dá)TXNIP逆轉(zhuǎn)普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞損傷的影響

2.4 過表達(dá)TXNIP逆轉(zhuǎn)普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞p38/JNK通路的影響 與OGD/R組相比,Pra-100 μmol/L組心肌細(xì)胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與Pra-100 μmol/L組相比,Pra-100 μmol/L+oe-NC組心肌細(xì)胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Pra-100 μmol/L+oe-NC組相比,Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP組心肌細(xì)胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 Western blot檢測過表達(dá)TXNIP逆轉(zhuǎn)普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞p38/JNK通路的影響

表6 Western blot檢測過表達(dá)TXNIP逆轉(zhuǎn)普拉克索對OGD/R心肌細(xì)胞p38/JNK通路的影響

3 討論

PCI術(shù)后缺血心肌組織恢復(fù)了血流供應(yīng),挽救了瀕臨死亡的心肌細(xì)胞,大大降低了心肌梗死患者的致殘率和死亡率[9]。然而,PCI治療并不能減輕或恢復(fù)心肌細(xì)胞的缺血性損傷,反而加重了部分AMI患者的心肌損傷程度[10]。如何預(yù)防和減輕AMI的I/R損傷已成為亟待解決的問題。

LDH和CK-MB在心肌細(xì)胞中有組成性表達(dá),在正常生理狀態(tài)下不能穿透細(xì)胞膜;但當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí),它們會被釋放出來[11]。因此,培養(yǎng)液中LDH和CK-MB的活性代表了OGD/R對H9c2細(xì)胞損傷的程度。已有研究表明,普拉克索在嗎啡誘導(dǎo)的小鼠不良心室重構(gòu)中發(fā)揮保護(hù)作用[12]。此外,普拉克索對心肌I/R損傷也具有保護(hù)作用[4]。結(jié)果表明,普拉克索可抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。心肌I/R損傷包括一系列復(fù)雜的病理過程,包括炎性反應(yīng)、鈣超載、補(bǔ)體激活、細(xì)胞自噬和凋亡[13]。研究證實(shí),氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在這一病理過程中起著重要作用。抑制I/R損傷后的氧化應(yīng)激水平和心肌細(xì)胞凋亡將是防治AMI I/R所致心肌損傷的重要手段[14]。目前的證據(jù)顯示,普拉克索通過其抗凋亡和抗氧化作用在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。本研究結(jié)果顯示,普拉克索可抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

TXNIP作為細(xì)胞氧化還原平衡的關(guān)鍵因子,是氧化應(yīng)激與炎癥損傷之間重要的橋梁[16]。TXNIP是組織I/R損傷過程的重要參與者。靶向TXNIP是保護(hù)大腦免受缺血性腦損傷的潛在治療策略[17];TXNIP還參與腸I/R損傷過程,二甲雙胍通過抑制TXNIP表達(dá)降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),從而改善小鼠腸I/R損傷[18];此外,TXNIP還參與心肌I/R損傷過程。刺芒柄花素通過抑制TXNIP介導(dǎo)的通路,減輕心功能不全、梗死面積、心臟標(biāo)志物釋放、ROS產(chǎn)生和炎性反應(yīng),從而改善大鼠心肌I/R損傷[19]。本研究結(jié)果顯示,普拉克索通過抑制TXNIP表達(dá)在OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

研究表明,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號的持續(xù)激活在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、促凋亡蛋白表達(dá)和ROS產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用[20]。p38和JNK是MAPK家族的成員[20],參與脊髓I/R損傷過程,抑制p38/JNK通路可減輕大鼠脊髓I/R損傷[21]。另有證據(jù)顯示,OGD/R處理可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞中p38/JNK通路的激活,靶向抑制p38/JNK通路促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡,從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R損傷[22]。此外,p38/JNK通路還參與心肌I/R損傷過程。抑制p38/JNK通路可抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,從而改善H9c2細(xì)胞I/R損傷[23]。目前,已有證據(jù)顯示,TXNIP可介導(dǎo)p38/JNK通路的活化。TXNIP通過激活p38/JNK通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,從而促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[24]。本研究結(jié)果顯示,普拉克索通過抑制TXNIP表達(dá)抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中p38/JNK通路激活。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,普拉克索可能通過下調(diào)TXNIP表達(dá)抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中p38/JNK通路激活,從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡,在OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。該研究結(jié)果為明確普拉克索在心肌I/R損傷中的作用及開發(fā)新的治療藥物提供了新的科學(xué)資料。