張劍鋒 肖南平 蔣麗琳

我國胃癌的發(fā)病率和死亡率均較高[1],患者早期無明顯癥狀,隨著病情的發(fā)展可出現(xiàn)消化不良等胃部不適癥狀,晚期會出現(xiàn)嘔吐、黑便、疼痛、腹部腫塊及盆腔或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等體征[2]。臨床針對胃癌患者常采取以手術(shù)切除為主的綜合治療方式,雖然有效延長了患者的生存期,但遠(yuǎn)期生存效果仍較差,相關(guān)數(shù)據(jù)顯示胃癌患者外科手術(shù)后的5年生存率約為21%～30%[3],因此,對胃癌患者遠(yuǎn)期生存影響因素的探討具有重要意義。部分研究發(fā)現(xiàn),胃癌的發(fā)生、發(fā)展與多條信號通路調(diào)控改變相關(guān)[4,5]。Kelch樣環(huán)氧氟丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap-1)是體內(nèi)各信號通路中一種非常重要的調(diào)節(jié)蛋白,可以與靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合[6]。有關(guān)研究報道,Keap-1在腺瘤及腺癌組織中高表達(dá),并與腺癌的浸潤程度及分化程度相關(guān)[7]。此外,核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)介導(dǎo)細(xì)胞的抗氧化反應(yīng),與疾病的發(fā)生關(guān)系密切[8],并在耿文靜等[9]的研究中,Nrf2過表達(dá)可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。以上研究均提示Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)可能參與癌癥的發(fā)生發(fā)展,但此二者是否與胃癌患者術(shù)后遠(yuǎn)期生存相關(guān)尚有待進(jìn)一步分析。鑒于此,本研究特對胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)與患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)系展開探討,以期為臨床治療與防控提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2015年1月至2017年2月在本院行根治性手術(shù)治療的147例胃癌患者臨床資料,其中男83例,女64例;年齡37～78歲,平均年齡(55.33±10.23)歲;體重指數(shù)(BMI)為(21.09±1.39)kg/m2;組織分化:低分化50例,中高分化97例。TNM分期:Ⅰ期33例,Ⅱ期40例,Ⅲ期54例,Ⅳ期20例;組織類型:鱗癌24例,腺癌123例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移98例;術(shù)后輔助化療73例。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn),患者及其家屬均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前行胃鏡及病理學(xué)檢查確診為胃癌;②初治,均符合根治性手術(shù)適應(yīng)癥,并接受根治性手術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù);③術(shù)前均未進(jìn)行放化療、靶向治療。④術(shù)中均留取患者胃癌組織和癌旁正常組織(距癌≥5 cm),并放置于液氮中保存;⑤臨床資料保存完整,且有隨訪記錄。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前檢查及術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,手術(shù)未達(dá)到根治性切除;②殘胃癌;③合并心、肝、腎等嚴(yán)重臟器功能障礙;④合并免疫系統(tǒng)疾病者;⑤合并其他惡性腫瘤;⑥伴腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器:組織包埋儀(LEUKA FG1150H)、全自動組織脫水儀(LEIKA TP1020)、冷凍切片機(jī)(LEICA CM1950,德國),DML型倒置顯微鏡(德國Leica公司);Keap1(1∶100)兔抗人多克隆抗體購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司;Nrf2(1∶150)兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司;磷酸鹽(PBS)緩沖液、抗原修復(fù)液、通用型二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、蘇木素染色液購自福州邁新公司。

1.3.2 組織Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)檢測:采用免疫組化法檢測患者胃癌組織和癌旁正常組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)。將術(shù)中留取的胃癌組織與癌旁正常組織放入10%中性甲醛固定,石蠟包埋,3 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇浸泡,微波抗原修復(fù),血清抗原修復(fù),滴加兔抗人Keap1、Nrf2一抗(Keap1兔抗人多克隆抗體,稀釋比為1∶100;Nrf2兔抗人多克隆抗體,稀釋比為1∶150),4℃冷藏過夜,次日PBS漂洗10 min,共3次。滴加通用型二抗50 μl,37℃反應(yīng)2 h后,PBS漂洗10 min,共3次,隨后通過DAB進(jìn)行顯色,時長為3 min,蘇木素復(fù)染30 s,脫水,75%甘油封片。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織中Keap1、Nrf2蛋白表達(dá),每張切片隨機(jī)采集6個圖像,并通過南京大學(xué)捷達(dá)80i病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計算機(jī)圖像采集和分析。Keap-1以細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽性,Nrf2以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染成棕黃色為陽性。①根據(jù)染色細(xì)胞占比結(jié)果記分,占比≤5%計0分,占比>5%但≤25%計1分,占比>25%但≤50%計2分,占比>50%但≤75%計3分,占比>75%計4分;②依據(jù)染色細(xì)胞顯色深淺記分,細(xì)胞無顯色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分?？偡e分值=A×B,當(dāng)A×B=0時為陰性,A×B≥1均為陽性。

1.3.3 隨訪與分組:術(shù)后對患者進(jìn)行為期5年的跟蹤隨訪,并以患者死亡為隨訪終點,通過門診復(fù)查、電話/微信回訪或家庭訪視等形式記錄患者遠(yuǎn)期生存情況。將隨訪期間死亡的患者歸為死亡組,另將生存的患者歸為生存組。

1.3.4 術(shù)后遠(yuǎn)期生存的影響因素分析:整理可能影響胃癌患者根治性術(shù)后遠(yuǎn)期生存的相關(guān)因素,如年齡、性別、BMI、腫瘤大小、病灶部位、組織類型、分化程度、TNM分期、手術(shù)方式、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后輔助化療、Keap-1蛋白表達(dá)、Nrf2蛋白表達(dá),將其作為自變量,另將遠(yuǎn)期生存不良作為因變量,對變量進(jìn)行賦值。見表1。

表1 變量賦值

1.4 觀察指標(biāo) (1)比較患者胃癌組織與相應(yīng)癌旁正常組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)情況;(2)比較胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)陽性者與表達(dá)陰性者的中位生存時間;(3)比較生存組和死亡組胃癌組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá);(4)胃癌患者遠(yuǎn)期生存的影響因素:比值比(OR)、95%可信區(qū)間(95%CI)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與相應(yīng)癌旁正常組織Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 胃癌組織中Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 胃癌組織與相應(yīng)癌旁正常組織Keap-1,Nrf2蛋白表達(dá)(免疫組化×400);A Nrf2蛋白在胃癌組織中陽性表達(dá);B Nrf2蛋白在癌旁正常組織中陰性表達(dá);C Keap-1蛋白在胃癌組織中陽性表達(dá);D Keap-1蛋白在癌旁正常組織中陰性表達(dá)

表2 胃癌組織與相應(yīng)癌旁正常組織Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 n=147,例(%)

2.2 胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者的中位生存時間比較 147例胃癌患者術(shù)后5年隨訪期間,均無失訪,其中患者死亡109例,生存38例,生存率25.85%。經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Keap-1蛋白陽性表達(dá)患者中位生存期低于Keap-1蛋白陰性表達(dá)患者(Log-rank =31.3241,P<0.001);Nrf2蛋白陽性表達(dá)患者中位生存期低于Nrf2蛋白陰性表達(dá)患者(Log-rank =24.358,P<0.001)。見圖2。

圖2 胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者生存曲線

2.3 生存組和死亡組Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 死亡組患者胃癌組織中的Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)率均高于生存組(P<0.05)。見表3。

表3 生存組和死亡組Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)比較 例(%)

2.4 胃癌患者遠(yuǎn)期生存的影響因素 死亡組腫瘤≥4.5 cm、低分化程度、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后輔助化療占比均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);并經(jīng)Cox比例風(fēng)險回歸模型分析,腫瘤≥4.5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后未輔助化療、Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)均是影響胃癌患者遠(yuǎn)期生存的危險因素(P<0.05)。見表4、5。

表4 死亡組和生存組遠(yuǎn)期影響因素比較

表5 Cox回歸模型分析

3 討論

胃癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的一種惡性腫瘤,是由多種因素所導(dǎo)致的,其中最主要的原因有幽門螺旋桿菌的感染、遺傳、基因以及不良生活習(xí)慣等[10]。根治性手術(shù)方式是臨床治療胃癌的主要手段,且近年來逐步開展的術(shù)前新輔助化療及免疫治療等綜合治療,從根本上改變了傳統(tǒng)的治療方式,使胃癌的總體療效明顯提高,但遠(yuǎn)期生存療效仍不佳[11]。

本研究結(jié)果顯示,胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織,提示Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap-1處于分子伴侶形式,而Keap-1作為負(fù)調(diào)控蛋白可以通過泛素蛋白酶體降解Nrf2,使其維持在較低水平。但由于氧化應(yīng)激在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[12],受其影響,Keap-1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,與Nrf2迅速解離,并喪失對Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,同時反應(yīng)性半胱氨酸殘基發(fā)生改變,降低了E3連接酶活性,導(dǎo)致Nrf2磷酸化,使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并逐漸累積,呈現(xiàn)高表達(dá)[13]。有研究發(fā)現(xiàn),Nrf2過度激活會增強(qiáng)細(xì)胞和組織的抗氧化能力,保護(hù)腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。另Keap-1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化會導(dǎo)致其功能喪失,影響對Nrf2的抑制活性,增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的生存率,并在有關(guān)研究中,Keap-1蛋白高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[15],也表明Keap-1蛋白表達(dá)與癌變的發(fā)生有關(guān),與本研究結(jié)果相似。

本研究中,經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Keap-1蛋白陽性表達(dá)患者中位生存期低于Keap-1蛋白陰性表達(dá)患者,Nrf2蛋白陽性表達(dá)患者中位生存期低于Nrf2蛋白陰性表達(dá)患者,且死亡組患者胃癌組織中的Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)率均高于生存組,經(jīng)Cox比例風(fēng)險回歸模型分析,Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)均是影響胃癌患者遠(yuǎn)期生存的危險因素,表明Keap-1、Nrf2蛋白的異常表達(dá)與胃癌患者遠(yuǎn)期生存具有一定聯(lián)系。國外研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤干細(xì)胞具有密切聯(lián)系,胃癌發(fā)生部位與胃癌干細(xì)胞定居部位一致,并具有許多共同特性,提示胃癌可能是一種干細(xì)胞疾病[16]。而Nrf2-NQO1信號通路在胃癌干細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用,激活該通路,可以誘導(dǎo)Nrf2的高表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)NQO1的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的耐受性,起到細(xì)胞保護(hù)作用[17]。且癌組織中Nrf2高表達(dá)可能是基因突變的結(jié)果,此時核內(nèi)轉(zhuǎn)位異常,Ⅱ相解毒酶基因不能有效激活,氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性加重,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,加重病情,影響遠(yuǎn)期生存[18]。Keap-1蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,部分功能喪失,對Nrf2的抑制活性降低,使Nrf2持續(xù)異常激活,導(dǎo)致其下游親電藥物解毒途徑的活性增強(qiáng),促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖,并且機(jī)體對化療藥物產(chǎn)生耐藥性,影響化療效果[19];此外,也有研究表明,Nrf2蛋白陽性表達(dá)與胃癌的侵襲呈正相關(guān),與輔助化療的耐藥性密切相關(guān),可以作為患者預(yù)后不良的潛在指標(biāo)[20]。另Keap-1還可以調(diào)控NF-κB信號通路,參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[21]。并在李璐等[22]的研究中,Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)可以影響肺癌患者的預(yù)后。而在銀萍等[23]的研究中,Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達(dá)與子宮頸病變患者預(yù)后有關(guān),以上均表明了Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)與癌變患者的遠(yuǎn)期生存具有一定聯(lián)系。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、術(shù)后輔助化療也是影響胃癌患者遠(yuǎn)期生存的影響因素,與既往研究[24]一致,分析原因:患者腫瘤越大,對胃壁的侵犯越廣,手術(shù)徹底根治的難度增加,術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險提升,同時癌細(xì)胞更易侵犯淋巴管,導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性增加,預(yù)后較差,從而影響患者遠(yuǎn)期生存狀況;當(dāng)患者分化程度較低時,具有較明顯的細(xì)胞異型性,生物惡性程度較高,侵襲性強(qiáng),多引起早期局部淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會增加患者術(shù)后發(fā)生腫瘤局部殘留和遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶的幾率,進(jìn)而影響患者遠(yuǎn)期生存;此外,TNM分期可以反應(yīng)腫瘤的進(jìn)展?fàn)顩r,當(dāng)TNM分期較高時,患者腫瘤浸潤漿膜后癌細(xì)胞極易脫落并造成腹腔種植散播,不利于預(yù)后,影響遠(yuǎn)期生存;另外胃癌患者術(shù)后輔助化療不僅可以鞏固手術(shù)療效,并且對術(shù)區(qū)切除不完全病灶、微轉(zhuǎn)移灶均有抑制作用,故術(shù)后輔助化療可以改善患者遠(yuǎn)期生存情況。

綜上所述,胃癌組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)失衡對胃癌患者的遠(yuǎn)期生存具有一定影響,而對二者的調(diào)控是否可能成為胃癌患者遠(yuǎn)期生存治療一個新方向,值得進(jìn)一步的探究。此外,腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期也是胃癌患者遠(yuǎn)期生存的影響因素,臨床可采取針對性措施,進(jìn)行有效的防治。