陶志云　朱春紅　劉宏祥　施祖灝　章雙杰　徐文娟　宋衛(wèi)濤　王志成　李慧芳

摘要： 本研究根據(jù)金定鴨個體蛋質(zhì)量情況，選擇2種極端表型，分為高蛋質(zhì)量組（WH）和低蛋質(zhì)量組（WL）?；诨斐厝蚪M重測序和選擇清除分析技術(shù)篩選組間差異顯著基因組區(qū)域內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點及相關(guān)功能基因，并通過單個樣本重測序?qū)Y選的蛋質(zhì)量相關(guān)SNP進行驗證，分析各SNP位點不同基因型之間的蛋質(zhì)量大小差異。研究發(fā)現(xiàn)，在低蛋質(zhì)量組和高蛋質(zhì)量組獲得的高質(zhì)量reads數(shù)量分別為194 115 424和228 089 084，共定位到SNP差異顯著區(qū)間178個，共富集到受選擇候選基因40個，而且這些區(qū)間和基因均位于Z號染色體。鑒定出候選基因ARSB上Z-22908831、Z-22966695突變位點顯著影響300 d、450 d蛋質(zhì)量，RORB上Z-35251072、Z-35256947突變位點顯著影響450 d蛋質(zhì)量，RORB上Z-35278196突變位點顯著影響300 d、450 d蛋質(zhì)量，RASEF上Z-39588570突變位點顯著影響450 d蛋質(zhì)量。本研究結(jié)果為通過分子育種技術(shù)提高蛋鴨產(chǎn)蛋性能選育提供了依據(jù)，加快了選育進程。

關(guān)鍵詞： 鴨；蛋質(zhì)量；遺傳變異；功能基因

中圖分類號： S834 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0461-10

Screening and identification of genetic variation and functional genes related to egg weight in ducks

TAO Zhi-yun¹， ZHU Chun-hong¹， LIU Hong-xiang¹， SHI Zu-hao²， ZHANG Shuang-jie¹， XU Wen-juan¹， SONG Wei-tao¹， WANG Zhi-cheng¹， LI Hui-fang¹

（1.Jiangsu Institute of Poultry Sciences， Yangzhou 225125， China；2.Pony Testing Group Jiangsu Co.， Ltd.， Suzhou 215123， China）

Abstract： In the study， two extreme phenotypes of Jinding ducks were selected according to individual egg weight： a high-egg-weight group （WH） and a low-egg-weight group （WL）. Single nucleotide polymorphism （SNP） sites and related functional genes that located in regions with significant genomic differences between the groups were screened based on mixed pool whole-genome re-sequencing and selective clearance analysis technology. The screened SNPs related to egg weight were verified by re-sequencing of each sample， and differences in egg weight between different genotypes of each SNP site were analyzed. Totals of 194 115 424 and 228 089 084 high-quality reads were obtained in the WL and WH groups， respectively. There were 178 significantly different SNP fragment regions， and 40 candidate genes were selected. These intervals and genes were located on chromosome Z. Z-22908831 and Z-22966695 mutation sites in the candidate gene ARSB significantly affected the egg weight of 300-day-old and 450-day-old ducks. Z-35251072 and Z-35256947 mutation sites in RORB significantly affected the egg weight of 450-day-old ducks. Z-35278196 mutation site in RORB significantly affected the egg weight of 300-day-old and 450-day-old ducks， and Z-39588570 mutation site in RASEF significantly affected the egg weight of 450-day-old ducks. These results provide a molecular basis for improving egg-laying performance and accelerating the breeding process in ducks.

Key words： duck;egg weight;genetic variation;functional gene

蛋鴨的產(chǎn)蛋性能，包括開產(chǎn)日齡、平均蛋質(zhì)量、產(chǎn)蛋數(shù)、蛋品質(zhì)等，是衡量其經(jīng)濟價值的主要指標^[1-2]。通過生物學(xué)方法，篩選影響蛋鴨產(chǎn)蛋性能的候選基因，將分子育種相關(guān)技術(shù)用于蛋鴨育種，是提高蛋鴨產(chǎn)蛋性能的有效手段^[1-2]。全基因組重測序技術(shù)是對基因組序列已知的個體進行全基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法，可挖掘出大量的遺傳變異位點^[3]，進而對挖掘的變異位點進行定位和鑒定，發(fā)現(xiàn)影響性狀的重要基因及其功能，從而闡釋性狀差異的原因^[4]。隨著測序成本的不斷降低，該技術(shù)已成為育種研究領(lǐng)域中快捷、有效的方法之一，在畜禽育種研究中也得到了廣泛應(yīng)用^[5]。目前，利用全基因組重測序技術(shù)對雞產(chǎn)蛋性能進行研究已獲得較大進展^[6]。如，Liu等^[7]發(fā)現(xiàn)13號染色體ODZ2基因上1個單核苷酸多態(tài)性（SNP）與開產(chǎn)日齡顯著相關(guān)，7號染色體GRB14基因上1個SNP與產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)；Shen等^[8]發(fā)現(xiàn)5號染色體GARNL1基因上5個SNP與開產(chǎn)日齡相關(guān)。Fan等^[9]發(fā)現(xiàn)9個與開產(chǎn)日齡及體質(zhì)量顯著相關(guān)的SNP，4個與產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)的SNP，5個與蛋質(zhì)量相關(guān)的SNP。全基因組重測序技術(shù)用于監(jiān)測鴨產(chǎn)蛋性能的相關(guān)研究較少，在紹興鴨中發(fā)現(xiàn)了10個與產(chǎn)蛋性能顯著關(guān)聯(lián)的SNP，其中4個位于2號染色體的SNP與開產(chǎn)日齡相關(guān)，4個位于2號染色體和2個位于29號染色體的SNP與66周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著關(guān)聯(lián)^[1]。蛋質(zhì)量相關(guān)SNP的研究更是非常有限。本研究擬利用全基因組混池重測序和選擇清除分析技術(shù)，分析蛋質(zhì)量差異大的鴨群體，以期篩選、鑒定出鴨蛋質(zhì)量相關(guān)差異基因組區(qū)域內(nèi)的遺傳變異位點和功能基因，為通過分子育種技術(shù)提高蛋鴨產(chǎn)蛋性能提供依據(jù)，加快育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗鴨為金定鴨，來源于國家家養(yǎng)動物種質(zhì)資源庫，共500只，按照蛋鴨飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)，育成期結(jié)束后上籠飼養(yǎng)，在299 d、300 d、301 d、449 d、450 d和451 d時分別稱量蛋質(zhì)量，統(tǒng)計個體300 d和450 d的平均蛋質(zhì)量。

1.2 個體選擇和樣品采集

根據(jù)個體300日齡時蛋質(zhì)量情況分別選取蛋質(zhì)量高、蛋質(zhì)量低2種極端表型個體各30只，經(jīng)統(tǒng)計，高蛋質(zhì)量組（WH）的平均蛋質(zhì)量為（86.09±2.22） g，低蛋質(zhì)量組（WL）的平均蛋質(zhì)量為（64.43±1.68） g，差異極顯著（P＜0.01）。分別采集2組個體的抗凝血，置于-20 ℃冰箱，用于DNA提取。

1.3 DNA提取、文庫構(gòu)建及測序

基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法，提取后用NanoDrop2000分光光度計檢測其純度和質(zhì)量濃度。采用NEB建庫試劑盒進行建庫，再用儀器qPCR-ABI7500、Agilent2100對文庫進行定量和檢測。庫檢合格后，在Hiseq X10 PE150平臺進行雙末端（PE）測序。最后去除片段低于10 bp的低質(zhì)量reads以及一些接頭被污染的reads，獲得clean reads。

1.4 序列比對、基因變異的檢測

利用比對軟件BWA將獲得的clean reads數(shù)據(jù)比對到參考基因組，利用軟件Picard對結(jié)果進行排序并標記重復(fù)序列。用Samtols軟件將比對結(jié)果轉(zhuǎn)換成Mpileup格式，轉(zhuǎn)換過程中，將堿基質(zhì)量值小于20和質(zhì)量值小于20的堿基去除。轉(zhuǎn)換成Mpileup格式后，為避免插入/缺失（InDel）引起的SNP簇對計算結(jié)果的影響，將InDel及InDel附近5 bp內(nèi)的變異位點去除。

1.5 選擇清除分析

基于過濾后的Mpileup文件，使用Popoolation軟件計算單個混池內(nèi)的π值，將2個池的π值相除，獲得π-ratio指標（piRatio）。將2個混池的Mpileup格式轉(zhuǎn)換為Sync格式（Popoolation2專用格式）后，用Popoolation2軟件進行混池間的固定指數(shù)（Fst）計算。

1.6 SNP準確性檢驗

基于Illumina X-10測序平臺對篩選獲得的遺傳變異進行單樣本的個體測序驗證。在差異顯著的基因組區(qū)間內(nèi)隨機選擇12個差異顯著的SNP，擴增出2個混池中60個個體的目標位點片段，統(tǒng)計每個個體12個位點的基因分型情況。

1.7 不同基因型鴨蛋質(zhì)量差異分析

采用SPSS20.0軟件對在WH、WL組間基因組差異顯著區(qū)域內(nèi)隨機選擇的12個多態(tài)位點基因型鴨300 d、450 d時蛋質(zhì)量進行One-way ANOVA分析，比較各位點不同基因型間的蛋質(zhì)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果概述

2.1.1 全基因重測序和組裝 表1顯示，WL、WH 2個混池得到的reads數(shù)分別為195 579 134和229 696 180，過濾后得到的高質(zhì)量reads數(shù)分別為194 115 424和228 089 084，過濾率均超過99%。2個池比對到基因組上的reads數(shù)分別為186 063 404和218 730 593，比對率超過95%，2個池分別產(chǎn)生6 652 356個和6 731 941個SNP。

2.1.2 SNP在基因組中的分布 表2顯示，在WH和WL中均獲得了大量的SNP，其中在外顯子區(qū)的SNP數(shù)量分別為124 776和123 833，內(nèi)含子區(qū)的SNP數(shù)量分別為3 431 865和3 394 802。

2.1.3 SNP編碼信息統(tǒng)計 對WH和WL的鴨進行DNA測序，統(tǒng)計分析比對后獲得的SNP編碼信息情況，結(jié)果（表3）表明，2組獲得的非同義突變數(shù)分別為29 237和29 089，同義突變數(shù)分別為87 178和86 418。

2.2 鴨高蛋質(zhì)量組和低蛋質(zhì)量組的選擇清除分析

通過群體多樣性差異指標分析WL和WH 2個群體SNP在染色體上的多樣性差異情況，2個群體多樣性差異主要分布在1號、2號、3號、4號、5號及Z號染色體（圖1A）。由WL和WH 2個群體固定指數(shù)值分布的曼哈頓圖（圖1B）可知，2個群體遺傳分化相對嚴重的區(qū)域集中位于Z號染色體。

結(jié)合固定指數(shù)、多樣性差異倍數(shù)的結(jié)果，各自按0.01水平篩選顯著區(qū)域，交集部分為可靠的候選區(qū)間，共定位到178個SNP顯著差異區(qū)間（圖1C），這些區(qū)間均位于Z號染色體，對2個指標篩選出的顯著區(qū)間，提取出各自區(qū)間的基因，并用韋恩圖將2個區(qū)間基因的交集和并集情況進行展示，共富集到40個受選擇候選基因（圖1D）。

2.3 鴨高蛋質(zhì)量組和低蛋質(zhì)量組的受選擇基因

通過Fst和π-Ratio指標確定的40個受選擇基因情況見表4，其中包括與跨膜轉(zhuǎn)運、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)的Slc49a3、TRPM6、Sema4d、RASEF；與發(fā)育相關(guān)的NIPBL、ZFAND5等，有多個基因功能未知。

2.4 測序結(jié)果準確性驗證

使用Illumina X-10測序平臺對60個樣本12個SNP位點進行單樣本的個體重測序，以驗證等位基因頻率準確性，結(jié)果（表5）表明，全基因組混池重測序和單個樣本重測序所得等位基因頻率的一致性為0.833。

2.5 候選基因GO富集分析

將獲得的差異基因向GO數(shù)據(jù)庫的各條目映射，計算每個條目的基因數(shù)并分類統(tǒng)計，圖2顯示，在0.01水平，這些差異基因在生物過程、細胞組分、分子功能中均有涉及。在生物過程方面，以細胞過程、單生物體過程、生物過程調(diào)節(jié)、生物調(diào)節(jié)、代謝過程幾個條目中涉及基因較多，數(shù)量分別為14、13、12、12、11；在細胞組分方面，以細胞器、細胞、細胞部分幾個條目中涉及基因較多，數(shù)量分別為12、11、11；在分子功能方面，以結(jié)合、催化活性2個條目中涉及基因較多，數(shù)量分別為14和4。

2.6 候選基因KEGG分析

進行通路顯著性富集分析，前20個顯著富集的KEGG通路見圖3，其中代謝通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中富集的基因最多，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑次之，富集到代謝通路的基因包括Gda、ACO1、Bhmt、DMGDH、MAN2A1、ARSB。

2.7 12個突變位點不同基因型鴨蛋質(zhì)量差異分析

將篩選獲得的12個突變位點不同基因型鴨個體蛋質(zhì)量數(shù)據(jù)進行差異分析，結(jié)果（表6）表明，ARSB基因上突變位點Z-22908831的G→A的突變引起300 d、450 d蛋質(zhì)量顯著下降（P＜0.05）；ARSB基因上突變位點Z-22966695的A→G的突變和RORB基因上突變位點Z-35278196的T→C的突變引起鴨300 d和450 d蛋質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；RORB基因上突變位點Z-35251072的C→T突變以及Z-35256947的T→C的突變引起鴨450 d蛋質(zhì)量顯著增加；RASEF基因上突變位點Z-39588570的A→G突變引起450 d蛋質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

全基因組關(guān)聯(lián)（GWAS）技術(shù)被廣泛用于遺傳變異的發(fā)現(xiàn)和新基因的挖掘，且取得了較大進展。本研究利用全基因組重測序技術(shù)對金定鴨WL和WH 2個不同蛋質(zhì)量組進行混池重測序，獲得的高質(zhì)量reads數(shù)分別為194 115 424和228 089 084，比對到基因組的比對率均高于95%，獲得的SNP數(shù)量分別為6 652 356和6 731 941，說明本研究的測序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)差異分析。采用選擇清除分析共定位到SNP差異顯著的基因組區(qū)間為178個，受選擇候選基因為40個，這些差異基因組區(qū)間和基因均位于Z號染色體，說明Z號染色體與鴨蛋質(zhì)量密切相關(guān)。在受選擇區(qū)間內(nèi)選擇12個突變位點進行個體測序驗證，結(jié)果與全基因組混池重測序的一致性為83.33%，說明全基因組混池結(jié)果可靠，可用于進一步數(shù)據(jù)分析。

有研究結(jié)果表明，影響蛋質(zhì)量的因素很多，其中遺傳因素是重要的影響因素之一^[10]，蛋質(zhì)量的遺傳力較高，可達到0.450～0.550^[11]，山麻鴨的300日齡蛋質(zhì)量遺傳力高達0.614^[12]，因此，可通過選育改變蛋質(zhì)量。蛋質(zhì)量大小受到多個基因控制^[11]，禽類中與蛋質(zhì)量相關(guān)的基因有PRL^[13]、PRLR^[14]、GHR^[15]、GnIH^[16]、OVR^[17]、VIPR-1^[18]等。最近在雞的研究中發(fā)現(xiàn)了一些新的候選基因，包括PRKAR2B、HMGA2、LEMD3、GRIP1、EHBP1、MAP3K7和MYH^[19]，在鴨的研究中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新的與蛋質(zhì)量相關(guān)的基因，如COLX^[20]、PNRC^[21]、CA2^[22]。本研究在鴨蛋質(zhì)量差異較大的2個群體中，發(fā)現(xiàn)40個與300 d、450 d蛋質(zhì)量相關(guān)的受選擇基因，主要包括參與跨膜轉(zhuǎn)運的Slc49a3、RASEF、TRPM6，參與DNA損傷修復(fù)的GADD45G，尿鎂鈣排泄相關(guān)的NMRK1，具有催化活性的Gda、Bhmt和DMGDH，具有水解作用的MAN2A1、LPL、ARSB，與發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的NIPBL、ZFAND5，與微管蛋白結(jié)合活性相關(guān)的MAP1B、TPPP2，以及與晝夜節(jié)律相關(guān)的RORB等，這些基因均是在鴨上新發(fā)現(xiàn)的與蛋質(zhì)量相關(guān)的候選基因。

對獲得的受選擇基因進行GO富集分析和KEGG分析，GO分析結(jié)果表明，在生物進程分類中，受選擇基因主要涉及單生物體過程、細胞過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)；細胞組分分類中，受選擇基因主要涉及細胞、細胞部分和細胞器；在分子功能分類中，受選擇基因主要涉及結(jié)合、催化活性。KEGG分析結(jié)果表明，受選擇基因以代謝通路信號途徑中參與的基因最多，包括Gda、ACO1、Bhmt、DMGDH、MAN2A1和ARSB，推測這些基因可能是通過參與物質(zhì)代謝過程調(diào)節(jié)蛋質(zhì)量大小。

RORB是一種孤兒核受體，與維甲酸、甲狀腺激素受體相關(guān)，主要在大腦皮質(zhì)、丘腦中表達，在視交叉上核、松果體和視網(wǎng)膜中也有表達，而且在松果體和視網(wǎng)膜中mRNA的豐度隨晝夜節(jié)律振蕩，在夜間達到峰值^[23]。RORB^-/-小鼠表現(xiàn)出鴨子般的步態(tài)、視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷、雄性生育能力延遲等^[24]。小鼠RORβ缺乏，還表現(xiàn)出晝夜節(jié)律異常^[25]，研究結(jié)果表明，RORs可被BMAL1、CLOCK和CRY1等幾個時鐘基因識別，從而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律^[26-29]。除此之外，RORs還調(diào)節(jié)下游靶基因的節(jié)律表達，因此，RORs可作為耦合晝夜節(jié)律振蕩與各種生理過程的循環(huán)控制的中間產(chǎn)物，包括能量平衡、脂質(zhì)代謝等^[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，RORB基因上3個位點突變顯著影響300 d或450 d的鴨蛋質(zhì)量，推測鴨RORB可能是通過調(diào)控鴨晝夜節(jié)律基因的表達而影響其能量代謝過程，從而引起蛋質(zhì)量的變化。

ARSB的2個位點Z-22908831、Z-22966695突變顯著影響300 d、450 d蛋質(zhì)量。ARSB是一種溶酶體酶，這種酶活性的缺乏會導(dǎo)致未降解底物的積累和溶酶體儲存障礙，即粘多糖病VI型。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ARSB的多個突變均與人的VI型粘多糖病相關(guān)^[32-34]，尚未見ARSB在禽類中的相關(guān)報道，本研究首次發(fā)現(xiàn)ARSB的位點突變與蛋質(zhì)量相關(guān)，提示鴨的ARSB基因可能通過影響機體代謝參與鴨產(chǎn)蛋過程。

RASEF（含RAS和EF域的蛋白質(zhì)）屬Rab GTPase蛋白家族成員，在C端區(qū)域包含1個Rab GTPase結(jié)構(gòu)域，內(nèi)部區(qū)域包含1個卷曲的線圈基序和2個EF結(jié)構(gòu)域，它們對結(jié)合N端的鈣離子非常重要^[35-36]。研究結(jié)果表明，Rab45/RASEF可在人的心、肝、肺、腎臟、前列腺和睪丸等中檢測到^[35]，而且與結(jié)直腸癌^[37-38]、肺癌^[35]、葡萄膜黑色素瘤^[39]、乳腺癌^[40-42]等腫瘤相關(guān)，RASEF在腫瘤中的作用機制可能是通過抑制腫瘤細胞的生長從而抑制腫瘤^[38-39]。本研究首次發(fā)現(xiàn)RASEF點突變與鴨蛋質(zhì)量相關(guān)，但具體調(diào)節(jié)機制有待進一步挖掘。

4 結(jié)論

本研究通過高通量混池重測序結(jié)合選擇清除分析技術(shù)篩選鴨蛋高質(zhì)量組、低質(zhì)量組組間基因組差異顯著區(qū)域內(nèi)的SNP和功能基因，篩選到178個定位于Z號染色體與鴨蛋質(zhì)量相關(guān)的SNP顯著差異區(qū)間及40個受選擇候選基因。KEGG分析結(jié)果表明，這些受選擇SNP位點和基因主要涉及代謝通路。通過比較12個突變位點不同基因型間鴨300 d、450 d蛋質(zhì)量差異，鑒定出一些蛋質(zhì)量相關(guān)候選突變位點及基因，這些基因可作為目標候選基因做進一步研究。本研究結(jié)果可為通過分子育種技術(shù)提高蛋鴨產(chǎn)蛋性能選育提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：王 妮）