魏清宇　吳鵬飛　葉紅心　李培峰　崔少華　張旗　張麗　張跟喜

摘要： 骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)肉雞產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要，可變剪切（AS）作為生物體內(nèi)一種普遍存在的調(diào)控機(jī)制，在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本研究以快長(zhǎng)型、慢長(zhǎng)型邊雞品系為試驗(yàn)材料，收集受精蛋后孵化至14胚齡和20胚齡，然后采集雞胚腿肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，用于分析骨骼肌發(fā)育過程中的差異可變剪切事件。在14胚齡慢長(zhǎng)型（S14）與14胚齡快長(zhǎng)型（F14）比較組中共發(fā)生230個(gè)差異可變剪切事件，其對(duì)應(yīng)了200個(gè)基因，在20胚齡慢長(zhǎng)型（S20）與20胚齡快長(zhǎng)型（F20）比較組中共發(fā)生373個(gè)差異可變剪切事件，其對(duì)應(yīng)了324個(gè)基因，且2個(gè)比較組中存在47個(gè)相同的基因。GO富集分析結(jié)果表明，前20個(gè)富集條目中包括絲氨酸家族氨基酸分解代謝過程、肌球蛋白II細(xì)絲組裝和肌動(dòng)球蛋白結(jié)構(gòu)組織等與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，前20條通路中有多條通路與骨骼肌發(fā)育相關(guān)，包括黏附連接、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和黏著斑等?；赟TRING數(shù)據(jù)庫對(duì)所有差異可變剪切事件的來源基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，然后利用Cytoscape（3.8.2）軟件中的插件CytoHubba篩選核心基因，結(jié)合富集分析結(jié)果在S14與F14比較組中發(fā)現(xiàn)TLN2、PARVB和ITGA6等多個(gè)關(guān)鍵候選基因，在S20與F20比較組中發(fā)現(xiàn)LDB3、PDLIM3、ITGB5、DMD、TNS3和RAC1等多個(gè)關(guān)鍵候選基因，同時(shí)，篩選到的PDLIM5和GIT1候選基因在14胚齡、20胚齡邊雞骨骼肌發(fā)育中均發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步解析骨骼肌發(fā)育調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為黃羽肉雞的選育工作提供一定參考。

關(guān)鍵詞： 骨骼肌；可變剪切；雞

中圖分類號(hào)： S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）02-0444-09

Differential alternative splicing during embryonic skeletal muscle development in fast-growing and slow-growing strains of Bian chicken

WEI Qing-yu¹， WU Peng-fei²， YE Hong-xin¹， LI Pei-feng¹， CUI Shao-hua¹， ZHANG Qi¹， ZHANG Li¹， ZHANG Gen-xi²

（1.College of Animal Science， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030032， China;2.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract： The growth and development of skeletal muscle is vital to the broiler industry. Alternative splicing （AS） is a universal regulation mechanism in organisms and plays an important role in the development of skeletal muscle. The fast-growing and slow-growing groups of Bian chicken were used as trial materials. After the fertilized eggs were collected and incubated to 14 and 20 days， the leg muscles of Bian chickens were collected for RNA-seq. Results showed that 230 and 373 differentially expressed alternative splicing events （DEAS） were found in S14 （14-day embryos of slow-growing chicken） vs F14 （14-day embryos of fast-growing chicken） and S20 （20-day embryos of slow-growing chicken） vs F20 （20-day embryos of fast-growing chicken） groups， corresponding to 200 and 324 host genes respectively. There were 47 same host genes in the two comparison groups. GO analysis results showed that biological processes （BP） terms related to skeletal muscle development in the top 20， such as serine family amino acid catabolic process， myosin II filament assembly and actomyosin structure organization， were obtained. KEGG enrichment analysis found that some of the top 20 pathways were also related to skeletal muscle development， including adherens junction， regulation of actin cytoskeleton and focal adhesion. Protein-protein interaction network （PPI） analysis was performed for the host genes of all the DEAS. Key candidate host genes were further screened using the plug-in CytoHubba combined with functional enrichment results. Key candidate host genes TLN2， PARVB and ITGA6 were found in S14 vs F14 group， and LDB3， PDLIM3， ITGB5， DMD， TNS3 and RAC1 were found in S20 vs F20 group. The results also showed that PDLIM5 and GIT1 were both important in the two comparison groups. These results can lay a foundation for further understanding and analyzing the regulation mechanism of skeletal muscle development， and also provide a reference for the breeding of yellow-feathered broilers.

Key words： skeletal muscle;alternative splicing;chicken

可變剪切（AS）是指前體mRNA在剪切體作用下選擇性去除或保留外顯子和內(nèi)含子，最終形成成熟mRNA的過程^[1-2]，該過程普遍存在于高等真核生物中，它是真核生物體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，是導(dǎo)致真核生物體中轉(zhuǎn)錄本差異和蛋白質(zhì)組多樣化的重要原因^[3-6]。

人類基因組中發(fā)生可變剪切的基因達(dá)90%以上^[3-4]，可變剪切主要包含以下7種（圖1）^{[3， 7]}。近年來，可變剪切調(diào)控在人類疾病中的作用逐漸被重視并揭示^[8-9]，此外，廣泛存在的各種形式的可變剪切還參與多種正常生命活動(dòng)和生物學(xué)調(diào)控過程，包括骨骼肌的發(fā)育^[10]。骨骼肌是保持人、動(dòng)物身體健康并維持運(yùn)動(dòng)能力的基礎(chǔ)。在畜禽行業(yè)，骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育情況決定了畜禽的屠宰性能，直接影響經(jīng)濟(jì)效益。心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D（MEF2D）是轉(zhuǎn)錄因子MEF2家族成員，在肌生成調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用^[11]，MEF2D基因通過可變剪切形成互斥型外顯子（MXE）剪切體亞型MEF2Dα1、MEF2Dα2^[12]，MEF2Dα1在肌肉分化過程中發(fā)揮抑制作用，而MEF2Dα2卻發(fā)揮著促進(jìn)作用。在骨骼肌中，胰島素和胰島素生長(zhǎng)素1（IGF1）均能通過與胰島素受體（INSR）結(jié)合激活PI3K/AKT/mTOR通路，調(diào)控肌肉肥大^[13]，然而，在轉(zhuǎn)錄過程中，INSR基因通過可變剪切能形成2種亞型INSR-A和INSR-B，其中，INSR-A亞型缺乏第11外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)與胰島素、IGF1均不結(jié)合，反而與胰島素生長(zhǎng)素2（IGF2）結(jié)合，而INSR-B亞型包含第11外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)對(duì)胰島素更加敏感，可調(diào)控肌肉肥大^[14]。不同可變剪切對(duì)骨骼肌發(fā)育影響差異較大，甚至造成相反的功效，因此，對(duì)可變剪切的研究具有重要意義。

胚胎期是骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，直接影響肌纖維的數(shù)量。本研究擬以慢長(zhǎng)型、快長(zhǎng)型邊雞品系為試驗(yàn)材料，分別在14胚齡和20胚齡運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）篩選胚胎期慢長(zhǎng)型、快長(zhǎng)型邊雞品系骨骼肌發(fā)育中的差異可變剪切事件，尋找影響骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵可變剪切事件及其來源基因，以期為進(jìn)一步解析并完善骨骼肌發(fā)育中可變剪切的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

邊雞是山西省的優(yōu)良地方雞品種，具有耐嚴(yán)寒、耐粗飼料等特點(diǎn)。300日齡時(shí)，收集慢長(zhǎng)型、快長(zhǎng)型邊雞品系中具有半同胞關(guān)系的種蛋進(jìn)行統(tǒng)一孵化，孵化至14胚齡、20胚齡時(shí)破除蛋殼，對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量稱量，同時(shí)，在14胚齡時(shí)采集尿囊液、20胚齡時(shí)采集微量全血用于性別鑒定，最后，統(tǒng)一采集右側(cè)腿肌置于液氮中保存。

母雞發(fā)育過程中右側(cè)性腺退化，通過解剖雛雞初步判斷其性別。然后利用雞尿囊液或微量全血進(jìn)行CHD1基因PCR擴(kuò)增，快速準(zhǔn)確鑒定其性別^[15]。本研究中使用的CHD1基因引物為F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′，R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′，使用的PCR試劑為2×Taq Plus Master Mix （Dye）。PCR反應(yīng)體系為：尿囊液2.0 μl或血液0.5 μl，正、反向引物各2.0 μl（10.0 μmol/L）、2×Taq Plus Master Mix （Dye）25.0 μl，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫10 min。最后，在14胚齡快長(zhǎng)型（F14）、14胚齡慢長(zhǎng)型（S14）、20胚齡快長(zhǎng)型（F20）和20胚齡慢長(zhǎng)型（S20）中分別選擇體質(zhì)量最接近的4只母雞的腿肌，提取RNA用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 總RNA提取及文庫構(gòu)建

采用傳統(tǒng)TRIzol法提取雞胚腿部組織RNA，樣品質(zhì)檢合格后委托北京諾禾致源科技股份有限公司構(gòu)建測(cè)序文庫^[16]，測(cè)序文庫質(zhì)檢合格后利用測(cè)序儀器NovaSeq 6000（Illumina公司產(chǎn)品）進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序原理是邊合成邊測(cè)序，最后生成150 bp長(zhǎng)度的原始測(cè)序序列，用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

原始數(shù)據(jù)中包含少量帶有測(cè)序接頭或測(cè)序質(zhì)量較低的測(cè)序序列，需對(duì)其進(jìn)行過濾：（1）去除帶接頭的測(cè)序序列；（2）去除N（N表示無法確定的堿基）占比大于0.002的測(cè)序序列；（3）去除低質(zhì)量測(cè)序序列。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)分析

將過濾得到的有效測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組后用于后續(xù)分析，比對(duì)軟件采用Hisat2（http：//ccb.jhu.edu/software/hisat2）^[17]，參考基因組為GRCg6a（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/gallus_gallus/dna/）。

1.5 可變剪切事件差異分析及其功能富集

基于比對(duì)結(jié)果，利用rMATS軟件^[18]對(duì)可變剪切事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、定量分析和差異分析。rMATS軟件可分析5種可變剪切事件，分別為外顯子跳躍型可變剪切（SE）、內(nèi)含子滯留型可變剪切（RI）、互斥外顯子型可變剪切（MXE）、5′端可變剪切（A5SS）和3′端可變剪切（A3SS）。

差異可變剪切事件來源基因的功能富集分析涉及GO和KEGG。GO是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，包括分子功能（MF）、生物過程（BP）和細(xì)胞組成（CC）3個(gè)部分。KEGG^[19]是整合了基因組和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫，在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過KEGG通路富集分析可以探尋差異表達(dá)可變剪切事件來源基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究利用GOseq^[20]軟件進(jìn)行GO富集分析，用KOBAS（3.0）^[21]軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.6 基于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵核心基因

利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步對(duì)2個(gè)比較組中所有差異可變剪切事件來源基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析（PPI），用Cytoscape（3.8.2）軟件中的插件CytoHubba采用最大集團(tuán)中心性（MCC）算法篩選核心基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為MCC值＞50。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

本研究利用SPSS13.0軟件對(duì)體質(zhì)量進(jìn)行顯著性分析，采用的方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，最終數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 個(gè)體體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

對(duì)送樣個(gè)體體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，S14：（9.26±0.55） g；F14：（11.24±0.54） g；S20：（32.60±1.47） g；F20：（39.26±2.07） g。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，快長(zhǎng)型個(gè)體14胚齡時(shí)的平均體質(zhì)量極顯著高于慢長(zhǎng)型個(gè)體（P=0.005），20胚齡時(shí)快長(zhǎng)型個(gè)體平均體質(zhì)量也極顯著高于慢長(zhǎng)型個(gè)體（P=0.004）。說明快長(zhǎng)型個(gè)體與慢長(zhǎng)型個(gè)體的體質(zhì)量在胚胎期具有較大的表型差異。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及比對(duì)結(jié)果分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)個(gè)體有效測(cè)序序列正確識(shí)別率＞99.90%（Q30）的堿基數(shù)占93.99%以上，正確識(shí)別率＞99.00%（Q20）的堿基數(shù)占98.00%以上。同時(shí)，每個(gè)個(gè)體有效測(cè)序序列中（G+C）含量為45.26%～48.49%，無堿基分離現(xiàn)象，以上結(jié)果表明測(cè)序數(shù)據(jù)良好。

與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測(cè)序序列可比對(duì)到外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)3個(gè)部分，且比對(duì)到外顯子的比例最高，符合預(yù)期，可用于后續(xù)分析。

2.3 差異可變剪切事件統(tǒng)計(jì)結(jié)果

以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)可變剪切事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2），在14胚齡快長(zhǎng)型個(gè)體與14胚齡慢長(zhǎng)型個(gè)體之間發(fā)生了230個(gè)差異可變剪切事件，其中外顯子跳躍型可變剪切事件有192個(gè)，內(nèi)含子滯留型可變剪切事件有7個(gè)，互斥外顯子型可變剪切事件有21個(gè)，5′端可變剪切事件只有1個(gè)，3′端可變剪切事件有9個(gè)。對(duì)20胚齡快長(zhǎng)型個(gè)體與20胚齡慢長(zhǎng)型個(gè)體之間發(fā)生的可變剪切事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共發(fā)現(xiàn)373個(gè)差異可變剪切事件，其中，外顯子跳躍型可變剪切事件有285個(gè)，互斥外顯子型可變剪切事件有49個(gè)。外顯子跳躍型可變剪切事件在14胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組和20胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中所占比例均為最高，且遠(yuǎn)高于其他類型，推測(cè)該種可變剪切在生物體內(nèi)普遍存在并發(fā)揮著重要作用。

2.4 差異可變剪切事件來源基因功能富集分析

對(duì)差異結(jié)果進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)S14與F14比較組中得到的230個(gè)差異可變剪切事件對(duì)應(yīng)了200個(gè)來源基因，S20與F20比較組中得到的373個(gè)差異可變剪切事件對(duì)應(yīng)了324個(gè)來源基因，2個(gè)比較組中相同的來源基因共47個(gè)。分別對(duì)S14與F14、S20與F20比較組中得到的可變剪切事件來源基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析結(jié)果（圖3）表明，在S14與F14比較組中顯著富集的前20個(gè)條目中有13個(gè)生物學(xué)過程（BP）條目，包含絲氨酸家族氨基酸分解代謝過程和肌球蛋白II細(xì)絲組裝等與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的條目；在S20與F20比較組中顯著富集的前20個(gè)條目中只有3個(gè)BP條目，其中線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和肌動(dòng)球蛋白結(jié)構(gòu)組織與骨骼肌發(fā)育相關(guān)。此外，骨骼肌收縮的調(diào)節(jié)、肌原纖維組裝和肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等顯著富集的前20個(gè)條目之外的其他BP條目也與骨骼肌發(fā)育相關(guān)。

KEGG通路富集分析結(jié)果（圖4）表明，在S14與F14比較組中前20條富集通路中有4條達(dá)到顯著水平，分別為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用、2-氧羰基酸代謝、氨基酸的生物合成和黏附連接，它們均在動(dòng)物骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；在S20與F20比較組中前20條KEGG通路中篩選到8條顯著富集的通路，其中mTOR信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和黏附連接等對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。在2個(gè)比較組的前20條KEGG通路中發(fā)現(xiàn)4條共同富集的通路，分別為黏附連接、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、黏著斑和真核生物核糖體生物發(fā)生，其中黏附連接是唯一共同顯著富集的通路，說明這4條通路及其基因以及發(fā)生的可變剪切事件可能在雞胚14胚齡、20胚齡骨骼肌發(fā)育時(shí)均發(fā)揮著重要作用。

2.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵核心基因

利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步對(duì)2個(gè)比較組中差異可變剪切事件來源基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，圖5為前100個(gè)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)圖，顏色越深表示其所處位置越核心。以MCC值＞50為條件，同時(shí)結(jié)合KEGG分析結(jié)果，在S14與F14比較組中我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)具有調(diào)控作用的核心蛋白質(zhì)，包括TLN2、PARVB和ITGA6。同時(shí)，KEGG結(jié)果顯示，在前20條通路中，TLN2、PARVB和ITGA6基因均富集在黏著斑通路中，ITGA6也富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路中；在S20與F20比較組中發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的核心蛋白質(zhì)，包括LDB3、PDLIM3、ITGB5、DMD、TNS3和RAC1等，其中，LDB3的MCC值最高。KEGG結(jié)果顯示，在前20條通路中，RAC1基因富集的通路高達(dá)5條，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、黏附連接、黏著斑等骨骼肌發(fā)育重要信號(hào)通路，ITGB5基因富集在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和黏著斑2條骨骼肌發(fā)育相關(guān)通路中。此外，我們發(fā)現(xiàn)PDLIM5和GIT1在14胚齡和20胚齡快長(zhǎng)型、慢長(zhǎng)型邊雞骨骼肌發(fā)育過程中均具有調(diào)控作用，結(jié)合可變剪切事件發(fā)生類型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在14胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中PDLIM5基因發(fā)生了SE型和MXE型2種差異的可變剪切事件，而在20胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中只發(fā)生SE型差異可變剪切事件，GIT1基因在2個(gè)不同胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中均發(fā)生了SE型差異可變剪切事件。

3 討論

可變剪切是真核生物體內(nèi)一種重要的調(diào)控機(jī)制，它能使同一基因產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，極大豐富了生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的多樣性^[22]。目前，關(guān)于可變剪切的研究涉及癌癥^[23]、衰老^[7]以及脂肪肝^[24]等。同樣，骨骼肌的發(fā)育也離不開可變剪切。Zhang等^[25]通過Rbm24基因敲除的小鼠活體試驗(yàn)結(jié)果證明了Rbm24能通過調(diào)控MEF2D、Naca、Rock2和Lrrfip1等肌源性基因的可變剪切進(jìn)而調(diào)節(jié)成年小鼠的骨骼肌再生；Li等^[26]采集兔子的肥胖模型和對(duì)照個(gè)體腿肌后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和DNA甲基化測(cè)序聯(lián)合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15個(gè)基因可通過可變剪切和DNA甲基化這2種類型的遺傳修飾共同調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育；Shu等^[27]采集肌內(nèi)脂肪含量不同的2種豬背最長(zhǎng)肌用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MRPL27、AAR2、PYGM、PSMD、MYL1、TNNT3和TNNT1等基因的可變剪切亞型可調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積。

雞肉是人類獲取動(dòng)物蛋白質(zhì)的重要來源，它具有“一高兩低”（高蛋白質(zhì)、低脂肪和低熱量）的特點(diǎn)，同時(shí)利于人體吸收，在市場(chǎng)上廣受歡迎。黃羽肉雞作為中國地方品種種質(zhì)資源，具有抗病力強(qiáng)，肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，滿足了市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)肉雞的需求，但黃羽肉雞生長(zhǎng)速度較慢，屠宰性能低，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，因此，提升黃羽肉雞生長(zhǎng)速度迫在眉睫。腿肌是骨骼肌的重要組成部分，腿肌率是肉雞屠宰性能測(cè)定中的一項(xiàng)重要指標(biāo)，直接影響了雞肉的產(chǎn)量，因此，研究腿肌生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理，對(duì)于提高黃羽肉雞的生長(zhǎng)速度具有重要指導(dǎo)作用。鄒小利^[28]的研究結(jié)果表明，14胚齡是地方雞品種肌纖維形成的關(guān)鍵時(shí)期，17胚齡之后形成完整的肌纖維輪廓，肌纖維數(shù)量也基本確定，出生后主要通過肌纖維肥大促進(jìn)骨骼肌發(fā)育^[29]，因此，胚胎期肌纖維的形成對(duì)骨骼肌發(fā)育至關(guān)重要。可變剪切在生物體內(nèi)普遍存在，并且在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，雞的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育同樣受可變剪切調(diào)控^[10]，然而對(duì)于可變剪切在雞骨骼肌發(fā)育中所起作用的研究較少。

本研究分別收集慢長(zhǎng)型、快長(zhǎng)型邊雞群體的受精蛋，孵化過程中采集14胚齡（肌纖維形成關(guān)鍵時(shí)期）、20胚齡（肌纖維數(shù)量已固定且未出殼）母雞腿肌用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，對(duì)篩選得到的差異可變剪切事件來源基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，同時(shí)結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行關(guān)鍵候選基因分析。在S14與F14比較組中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵候選來源基因包括TLN2、PARVB和ITGA6，在S20與F20比較組中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因包括LDB3、PDLIM3、ITGB5、DMD、TNS3、RAC1等，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)PDLIM5和GIT1對(duì)14胚齡、20胚齡邊雞的生長(zhǎng)發(fā)育均具有調(diào)控作用。

在S14與F14比較組的前20條通路中，我們發(fā)現(xiàn)TLN2、PARVB和ITGA6均富集在黏著斑通路中，此外，ITGA6也富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路中。黏著斑是細(xì)胞中的一種特殊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)中的整合素受體可以與細(xì)胞外基質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連，黏著斑在細(xì)胞中起著機(jī)械連接和信號(hào)傳遞的作用，與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)^[30-31]。細(xì)胞外基質(zhì)由不同的膠原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白組成^[32]，與細(xì)胞表面受體相結(jié)合形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，可以進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和分化等^[33]。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是細(xì)胞骨架的重要組成部分，它在骨骼肌的收縮過程中起著關(guān)鍵作用^[34]。

在S20與F20比較組的前20條通路中，RAC1富集的通路高達(dá)5條，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、黏附連接、黏著斑等骨骼肌發(fā)育重要信號(hào)通路。有研究發(fā)現(xiàn)，RAC1可在骨骼肌分化后期發(fā)揮重要作用，在成肌細(xì)胞融合過程中必不可少^[35]；其次為ITGB5，本研究發(fā)現(xiàn)該基因主要富集在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和黏著斑2條骨骼肌發(fā)育相關(guān)通路中。通過蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵核心基因，發(fā)現(xiàn)LDB3的MCC值最高。Yamashita等^[36]匯總了6種LDB3的可變剪切亞型，發(fā)現(xiàn)肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良Ⅰ型患者體內(nèi)包含外顯子11的LDB3可變剪切亞型極顯著升高，該亞型可能對(duì)骨骼肌發(fā)育造成不良影響。肌營養(yǎng)不良蛋白基因（DMD）突變可導(dǎo)致杜氏肌營養(yǎng)不良癥，主要引起骨骼肌、心肌退化^[37]。

在S14與F14、S20與F20比較組中我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)了多條與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的可變剪切事件，其來源基因包括PDLIM5和GIT1。He等^[38]研究發(fā)現(xiàn)，PDLIM5可以通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）的增殖和分化。Bahri等^[39]證實(shí)了GIT1基因在果蠅胚胎肌肉發(fā)育中必不可少，對(duì)其發(fā)育具有引導(dǎo)作用。在14胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中發(fā)現(xiàn)了PDLIM5基因SE型和MXE型2種差異的可變剪切事件，而在20胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中只發(fā)現(xiàn)了SE型差異可變剪切事件；GIT1基因在2個(gè)不同胚齡快長(zhǎng)型與慢長(zhǎng)型比較組中均發(fā)生了SE型差異可變剪切事件，提示不同可變剪切在骨骼肌發(fā)育中作用不同，不同胚齡骨骼肌發(fā)育過程可能由相同或不同可變剪切調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在快長(zhǎng)型、慢長(zhǎng)型邊雞品系胚胎期鑒定出多個(gè)與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)且存在差異的可變剪切事件，對(duì)其來源基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前20個(gè)條目中肌球蛋白II細(xì)絲組裝和肌動(dòng)球蛋白結(jié)構(gòu)組織等與骨骼肌發(fā)育相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，前20條通路中包含了黏附連接和黏著斑等與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的通路。對(duì)差異可變剪切事件來源基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，鑒定出多個(gè)與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵來源基因，包括TLN2、PARVB、LDB3、PDLIM3、RAC1、PDLIM5和GIT1等。以上研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步理解和解析骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中可變剪切的調(diào)控機(jī)理具有重要意義，同時(shí)，本研究結(jié)果對(duì)邊雞及中國其他黃羽肉雞的育種工作具有一定的參考作用。

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（責(zé)任編輯：王 妮）