楊曄妮 趙梓吟 王有鵬 孫洪發(fā) 張順 韓冰

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 肝膽胰外科;2 器官移植中心)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)病率在全球人群中位居第6位［1］,確診時間晚、高復(fù)發(fā)率和高死亡率是造成HCC患者不良預(yù)后的重要原因。研究顯示瘤內(nèi)缺氧是進展期HCC的關(guān)鍵特征,缺氧除可通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)引起肝癌細(xì)胞適應(yīng)性缺氧等的一系列變化,還具有影響腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體對免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞傳遞信號的作用［2-3］。

外泌體是一類粒徑30～150 nm的含有RNA和蛋白的盤狀囊泡,可在不同類型細(xì)胞之間起通訊作用［4］。研究發(fā)現(xiàn),外泌體中膜蛋白凋亡誘導(dǎo)因子6相互作用蛋白(Alix)高表達,而基本不表達鈣連接蛋白。缺氧環(huán)境可以影響肝癌細(xì)胞分泌和傳遞外泌體,從而影響腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞,包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的通訊［5-7］。

本課題組先前的實驗發(fā)現(xiàn),SOCS5可以調(diào)節(jié)HIF-1α依賴性的線粒體損傷,進一步促進HCC的進展［3］。但是在缺氧環(huán)境下,肝癌細(xì)胞是如何通過外泌體轉(zhuǎn)運核酸物質(zhì)到達巨噬細(xì)胞,以及誘導(dǎo)免疫抑制的具體機制目前尚不清楚。本研究通過構(gòu)建人HCC97H(MHCC97H)細(xì)胞缺氧模型,探討缺氧肝癌細(xì)胞源性外泌體miR-1260b對巨噬細(xì)胞M2亞型的影響及其機制,旨在為HCC的免疫治療提供新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

MHCC97H細(xì)胞和人單核白血病細(xì)胞(THP-1)均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,并通過短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析驗證了細(xì)胞的真實性;2.5 g/L胰蛋白酶溶液、高效RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物購自北京索萊寶科技有限公司,TRIzol購自美國Invitrogen公司。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理 97H細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM)中,在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱當(dāng)中進行培養(yǎng)。待97H細(xì)胞融合度達70%～80%后,在完全培養(yǎng)基中分別加入0、100 μmol/L濃度的CoCl2,培養(yǎng)24 h后提取RNA,實時熒光定量PCR方法(RT-qPCR)方法檢測細(xì)胞中HIF-1α的相對表達量,若HIF-1α穩(wěn)定高表達且兩種濃度間有顯著差異時,則為細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建成功［8-9］,可用于后續(xù)實驗。

將THP-1細(xì)胞置于THP-1專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)中,和97H細(xì)胞相同條件進行培養(yǎng),培養(yǎng)至對數(shù)生長期以后進行實驗。取THP-1細(xì)胞計數(shù)并接種于含有專用培養(yǎng)基的6孔板中,每孔約1×106個細(xì)胞,分別向?qū)Ｓ门囵B(yǎng)基中加入濃度0、100 μg/L的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)(美國MedChemExpress生物科技有限公司),分別為THP-1組和THP-1+PMA組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后使用RT-qPCR方法檢測兩組THP-1細(xì)胞中CD11b相對表達量,此時在THP-1+PMA組中得到的細(xì)胞即為M0巨噬細(xì)胞。然后于培養(yǎng)了24 h的THP-1+PMA組培養(yǎng)基中再加入100 μg/L的IL-4/IL-13,繼續(xù)培養(yǎng)72 h以后,得到M2巨噬細(xì)胞(M2組)［10］。

1.2.2細(xì)胞共培養(yǎng) 將M0巨噬細(xì)胞鋪至孔徑為0.4 μm的共培養(yǎng)板的上室內(nèi),分別將融合度達到70%～80%的97H細(xì)胞,以及細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建成功97H細(xì)胞鋪至共培養(yǎng)板的下室,分別為97H-N+M0組和97H-H+M0組,共培養(yǎng)48 h以后,采用RT-qPCR方法檢測上述兩組以及M2組巨噬細(xì)胞中TNF-α、CD163和CD206的相對表達量。

將M0巨噬細(xì)胞鋪至孔徑為0.4 μm的共培養(yǎng)板上室內(nèi),待97H細(xì)胞融合度達70%～80%時,分別轉(zhuǎn)染miR-1260b NC(97H-NC+M0組)和miR-1260b Mimic(97H-Mimic+M0組),并將其鋪至共培養(yǎng)板下室,共培養(yǎng)48 h,采用RT-qPCR方法檢測兩組細(xì)胞中TNF-α和CD206相對表達量。

將融合度達到70%～80%的97H細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1260b Inhibitor后,再加入100 μmol/L濃度的CoCl2缺氧處理24 h,即為97H-H-1260 IN組細(xì)胞。將M0巨噬細(xì)胞鋪至孔徑為0.4 μm的共培養(yǎng)板上室內(nèi),將上面獲得的97H-H-1260 IN組細(xì)胞(97H-H-1260 IN+M0組)以及融合度達到70%～80%的97H細(xì)胞(97H-N+M0組)和細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建成功97H細(xì)胞(97H-H+M0組)鋪至共培養(yǎng)板下室,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,RT-qPCR方法檢測上述4組M0巨噬細(xì)胞中TNF-α和CD206相對表達量。

1.3 外泌體的提取、鑒定及示蹤

將97H細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中,待細(xì)胞融合度達到70%～80%時,分別向完全培養(yǎng)基中加入0、100 μmol/L的CoCl2,培養(yǎng)24 h后,將培養(yǎng)基更換為DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.10無外泌體胎牛血清),分別為exo-N組和exo-H組,培養(yǎng)48 h后,采用低溫差速離心方法［11］提取exo-N組和exo-H組細(xì)胞上清液中的外泌體,并重懸于50～100 μL的PBS中。

取濃度為100 g/L的exo-N組外泌體顆粒,以Dil橙紅色熒光染料進行標(biāo)記。加至沒有染料標(biāo)記的M0巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中,共同孵育24 h后,利用熒光顯微鏡觀察M0巨噬細(xì)胞內(nèi)的熒光反應(yīng),若外泌體被巨噬細(xì)胞吞噬則出現(xiàn)橙紅色熒光顆粒。

取exo-N組和exo-H組的20 μL的外泌體顆粒懸液滴至電鏡銅網(wǎng)柵中,停留1 min,磷鎢酸溶液負(fù)染固定1～10 min,濾紙吸干后室溫自然晾干,在生物透射電子顯微鏡下觀察外泌體的大小和形狀,并拍照。使用納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)的ZetaVIEW S/N 252軟件分析外泌體顆粒的大小。

取exo-N組和exo-H組外泌體顆粒,設(shè)置濃度100 g/L,加至M0細(xì)胞培養(yǎng)基中,分別為exo-N+M0組和exo-H+M0組,培養(yǎng)48 h以后,通過RT-qPCR方法檢測兩組細(xì)胞中CD206相對表達量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

參考文獻［12］的方法,向M0巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-1260b NC、miR-1260b Mimic、miR-1260b NC-Inhibitor、miR-1260b Inhibitor,分別為M0-NC組、M0-Mimic組、M0-NC IN組、M0-IN組,向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1260b NC、miR-1260b Inhibitor,分別為M2-NC IN組和M2-IN組。采用RT-qPCR方法檢測以上各組巨噬細(xì)胞中TNF-α以及CD206的表達。miR-1260b NC引物的序列為：5′-UUCU-CCGAACGUGUCACGUTT-3′;miR-1260b Mimic引物的序列為：5′-AUCCCACCACUGCCACCAU-GGUGGCAGUGGUGGGAUUU-3。miR-1260b NC-Inhibitor引物的序列為：5′-CAGUACUUUUGUG-UAGUACAA-3′;miR-1260b Inhibitor引物的序列為：5′-AUGGUGGCAGUGGUGGGAU-3′。

1.5 RT-qPCR方法檢測外泌體中miR-1260b相對表達量

按照試劑盒說明書的要求,用TRIzol試劑提取exo-N組和exo-H組外泌體顆粒中的RNA,利用Nano Drop分光光度計檢測提取的RNA濃度以及純度,用TaKaRa(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)的SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ進行RT-qPCR。PCR反應(yīng)體系共20 μL,包括10 μL的PCR Master Mix、1 μg cDNA以及適宜濃度的DEPC水和引物。以U6為內(nèi)參。引物委托由上海生工生物工程有限公司合成,miR-1260b的特異性引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACAAAATA-3′,正向引物為：5′-CG-CGATCCCACCACTGC-3′,反向引物為：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6的特異性引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-GGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′,正向引物為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 Western blot方法檢測97H細(xì)胞和外泌體中Alix和鈣連接蛋白的表達水平

97H細(xì)胞融合度達到70%～80%時,使用RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解97H細(xì)胞(97H組),提取蛋白混合物。對新鮮提取的exo-N組和exo-H組的外泌體顆粒同時使用上述試劑進行裂解,提取蛋白混合物。采用BCA-蛋白定量法對樣品中的蛋白進行定量以后,使用SDS-PAGE凝膠分離蛋白,利用電場裝置將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,嚴(yán)格膜封閉后,一抗4 ℃下孵育過夜。與同種酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG-HRP(上海愛必信生物科技有限公司)抗體結(jié)合后,加入ECL發(fā)光溶液顯色后,采用成像儀檢測目標(biāo)蛋白的相對表達量。所用的抗體有抗-Alix、抗-Calnexin(1∶1 000,上海艾博抗貿(mào)易有限公司)、抗-GAPDH(1∶1 000,上海愛必信生物科技有限公司)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 缺氧97H細(xì)胞對巨噬細(xì)胞極化的影響

RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,THP-1組以及THP-1+PMA組細(xì)胞中CD11b基因的相對表達量分別為1.001±0.059、3.931±0.027,兩組比較差異具有顯著性(t=78.14,P<0.05)。

M2組、97H-N+M0組及97H-H+M0組巨噬細(xì)胞中CD163、CD206和TNF-α基因的相對表達量比較,差異均有顯著性(F=319.90～494.20,P<0.05),各組間兩兩比較差異均有顯著性(t=14.23～46.88,P<0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞中CD163、CD206和TNF-α基因相對表達量比較

2.2 缺氧肝細(xì)胞癌分泌的外泌體對巨噬細(xì)胞的攝取和極化產(chǎn)生的影響

Western blot方法結(jié)果顯示,與97H組比較,exo-N組和exo-H組提取的蛋白混合物中高表達Alix,基本不表達鈣聯(lián)蛋白(圖1)。生物透射電子顯微鏡以及NTA結(jié)果顯示,外泌體顆粒呈雙凹圓盤狀微小囊泡,直徑30～150 nm,見圖2。

圖1 缺氧肝癌細(xì)胞源性外泌體中Alix和鈣聯(lián)蛋白表達情況

圖2 缺氧肝癌細(xì)胞源性外泌體的形態(tài)(200倍)

RT-qPCR檢測的結(jié)果顯示,exo-N+M0組和exo-H+M0組M0巨噬細(xì)胞中CD206基因的相對表達量分別為1.000±0.010、2.852±0.188,兩組比較差異具有顯著性(t=17.06,P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察顯示M0巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)帶有橙紅色熒光的顆粒(圖中白色箭頭指示處),表示外泌體被M0巨噬細(xì)胞吞噬。見圖3。

圖3 缺氧肝癌細(xì)胞源性外泌體Dil熒光染色(50倍)

2.3 缺氧97H細(xì)胞來源的外泌體miR-1260b對M2巨噬細(xì)胞極化的影響

RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,exo-N和exo-H組外泌體中的miR-1260b基因的相對表達量分別為1.000±0.007、2.133±0.162,兩組比較差異有顯著性(t=12.09,P<0.05)。M0-NC組與M0-Mimic組的miR-1260b基因的相對表達量分別為1.000±0.038、32.903±0.570,CD206基因的相對表達量分別為1.001±0.049、1.325±0.337,TNF-α基因的相對表達量分別為1.000±0.021、0.705±0.058,M0-Mimic組與M0-NC組比較,miR-1260b、CD206基因的相對表達量顯著高表達(t=96.70、8.82,P<0.05),而TNF-α基因的相對表達量顯著降低(t=8.22,P<0.05)。

M2-NC IN組與M2-IN組中miR-1260b基因的相對表達量分別為1.000±0.035、0.052±0.002,CD206基因的相對表達量分別為1.002±0.069、1.000±0.021,TNF-α基因的相對表達量分別為1.000±0.008、3.428±0.249,M2-IN與M2-NC IN組比較,miR-1260b基因的相對表達量顯著降低,TNF-α基因的相對表達量則顯著增高(t=47.31、16.88,P<0.05),CD206基因的相對表達量比較無顯著差異(P>0.05)。

2.4 miR-1260b Mimic/Inhibitor對缺氧97H細(xì)胞誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,M0-NC+M0組與97H-Mimic+M0組M0巨噬細(xì)胞中的CD206基因的相對表達量分別為1.005±0.125、5.037±0.227,TNF-α基因相對表達量則分別為1.001±0.056、0.278±0.017,兩組比較,CD206和TNF-α相對表達量具有顯著差異(t=26.95、21.45,P<0.05)。

97H-N+M0組、97H-H+M0組以及97H-H-1260 IN+M0組M0巨噬細(xì)胞中的CD206基因的相對表達量則分別為1.001±0.053、3.209±0.576、0.652±0.038,TNF-α基因的相對表達量分別為1.003±0.049、0.456±0.025、1.089±0.026,各組間CD206和TNF-α比較差異均有顯著性(F=36.50、44.07,P<0.05),其中,與97H-H+M0組比較,97H-H-1260 IN+M0組M0巨噬細(xì)胞中CD206基因的相對表達量顯著降低,TNF-α基因的相對表達量顯著升高(t=9.09、12.54,P<0.05)。

3 討 論

我國是HCC高發(fā)國家,據(jù)統(tǒng)計人群中HCC發(fā)病率高達18.2/10萬［13-14］。TAM是腫瘤微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞,可以極化為M1或M2亞型,M2巨噬細(xì)胞具有促進腫瘤細(xì)胞進展的作用［15］。不同的巨噬細(xì)胞亞型均具有特異性標(biāo)志物,例如M0巨噬細(xì)胞以CD11b基因高表達為特征,M1巨噬細(xì)胞高表達TNF-α,而M2巨噬細(xì)胞則高表達CD206、CD163［10,16］。研究發(fā)現(xiàn),缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的外泌體中富含免疫調(diào)節(jié)蛋白和趨化因子［17］,還包含有能促進M2巨噬細(xì)胞極化的miRNA分子。

研究發(fā)現(xiàn),免疫細(xì)胞中的M2巨噬細(xì)胞可以通過上調(diào)PD-L1或者是分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10抑制CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性,以此重塑免疫微環(huán)境,從而促進肝癌細(xì)胞的免疫逃逸［18-20］。除此之外,M2巨噬細(xì)胞有促進血管和淋巴管生成、腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等作用,有促癌的作用,而M1巨噬細(xì)胞則具有抗癌的作用。因此探索缺氧腫瘤細(xì)胞通過分泌外泌體誘導(dǎo)M2-TAM極化的具體機制,找到控制TAM由M2轉(zhuǎn)化為M1表型的具體靶向分子,對于提高HCC患者的預(yù)后至關(guān)重要。目前在黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肺癌多種腫瘤中,均被證實缺氧腫瘤細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)腫瘤進展［17,21-23］。本研究結(jié)果顯示,缺氧97H細(xì)胞可以促進M2巨噬細(xì)胞極化,并高表達基因CD206、CD163,與WANG等［24］研究結(jié)果一致。同時本研究通過體外實驗首次證實,在M0巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1260b Mimic可以有效地誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化,而靶向抑制miR-1260b的表達則可以有效控制巨噬細(xì)胞M2亞型轉(zhuǎn)化為M1亞型。總之,本研究發(fā)現(xiàn)缺氧肝癌細(xì)胞來源的miR-1260b可以誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。

miRNA是一類不具有蛋白質(zhì)編碼功能的內(nèi)源性小分子RNA,主要通過特異性識別mRNA的3′非編碼區(qū)靶向降解mRNA,從而影響基因的表達水平,發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用［25］。研究發(fā)現(xiàn),相較于癌旁組織,miR-1260b在HCC組織當(dāng)中高表達,miR-1260b可以通過抑制G蛋白信號調(diào)節(jié)因子從而促進肝癌細(xì)胞的增殖,即miR-1260b具有促瘤效應(yīng)［26-27］。體外研究發(fā)現(xiàn),向巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中加入ERK抑制劑后,巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-1260b表達顯著上調(diào),miR-1260b可能是影響M2巨噬細(xì)胞極化的重要分子［28］。由此可以推測,在缺氧97H細(xì)胞影響巨噬細(xì)胞極化的這一過程中,miR-1260b可能是促進巨噬細(xì)胞M2標(biāo)記物CD206基因高表達的原因。并且,miR-1260b還被發(fā)現(xiàn)是缺氧肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中的差異性分子［29］。因此可以推斷,外泌體源性miR-1260b可能是缺氧環(huán)境下肝癌細(xì)胞調(diào)節(jié)M2巨噬細(xì)胞極化的主要分子。本研究通過提取以及分離缺氧97H細(xì)胞的外泌體,探究了miR-1260b對M2巨噬細(xì)胞極化的影響機制。本研究成功提取了外泌體顆粒,此顆粒已經(jīng)過NTA分析、生物透射電子顯微鏡觀察和Western blot方法驗證。然后,本研究將缺氧肝癌源性外泌體顆粒與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,缺氧腫瘤源性外泌體可以誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞高表達M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206。本研究還發(fā)現(xiàn)缺氧97H細(xì)胞來源的外泌體高表達miR-1260b基因,由此可以推測,miR-1260b極有可能是缺氧97H細(xì)胞通過外泌體誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵靶分子。

miRNA Mimic/Inhibitor是通過化學(xué)合成的方法合成的特定miRNA模擬物/抑制劑,可利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式進入細(xì)胞內(nèi)增強或削弱內(nèi)源miRNA的調(diào)控作用,以此進行功能獲得性/缺失性研究。為了進一步探究miR-1260b在誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞亞型極化中的作用,本研究向M0巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-1260b Mimic,結(jié)果顯示M2巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)志物CD206高表達,然而在M2巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-1260b Inhibitor后,結(jié)果顯示,可以顯著上調(diào)M1巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)志物TNF-α的表達,而對CD206的調(diào)節(jié)作用不明顯,提示miR-1260b可能是缺氧97H細(xì)胞源性外泌體中導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞極化的主要調(diào)節(jié)分子,并且在M2巨噬細(xì)胞中抑制miR-1260b的表達以后可以有逆轉(zhuǎn)M2巨噬細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)化為M1亞型的可能性。同時,本研究還發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了miR-1260b Mimic的肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)M0巨噬細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞的極化。而轉(zhuǎn)染了miR-1260b Inhibitor的缺氧97H細(xì)胞,相較于缺氧97H細(xì)胞共培養(yǎng)M0巨噬細(xì)胞后,可以有效逆轉(zhuǎn)缺氧97H細(xì)胞誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,缺氧97H細(xì)胞可以通過外泌體誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化,并且缺氧肝癌細(xì)胞源性外泌體中的miR-1260b被首次發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞極化發(fā)生免疫抑制的關(guān)鍵分子,為HCC免疫治療方面的研究提供了理論支持。

作者聲明：韓冰、楊曄妮、趙梓吟參與了研究設(shè)計;楊曄妮、王有鵬、孫洪發(fā)和張順參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者聲明不存在利益沖突。