王 娟 徐相波 張茂林 劉鐵山 徐 倩 董 瑞 劉春曉 關(guān)海英 劉 強(qiáng) 汪黎明 何春梅

一個(gè)新的玉米基因等位突變體的鑒定與遺傳分析

王 娟 徐相波 張茂林 劉鐵山 徐 倩 董 瑞 劉春曉 關(guān)海英 劉 強(qiáng) 汪黎明*何春梅*

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所 / 小麥玉米國(guó)家工程研究中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海北部玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東濟(jì)南 250100

籽粒發(fā)育是決定玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素, 但目前對(duì)其遺傳調(diào)控機(jī)制的研究還相當(dāng)不完善。我們?cè)谔镩g篩選到一個(gè)玉米籽粒發(fā)育突變體, 表現(xiàn)為籽粒灌漿不充分, 胚和胚乳變小, 成熟籽粒干癟或“空果皮”。該突變表型受單個(gè)隱性核基因控制。通過(guò)圖位克隆的方式將候選突變基因定位到2號(hào)染色體1.1 Mb的區(qū)間內(nèi), 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 該區(qū)間內(nèi)()基因在第1個(gè)外顯子處發(fā)生轉(zhuǎn)座子插入, 導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)和無(wú)義突變。此插入突變與突變體籽粒灌漿缺陷表型完全連鎖, 該突變體被命名為-。通過(guò)與突變體進(jìn)行等位測(cè)驗(yàn), 確認(rèn)-即為基因的等位突變體。因此, 本研究鑒定了一個(gè)新的等位突變體, 其突變位點(diǎn)及方式與已知突變體均不相同, 完善了玉米籽粒突變體的種質(zhì)資源信息, 也為Mn1調(diào)控籽粒發(fā)育機(jī)制的解析提供新的遺傳材料。

玉米; 籽粒灌漿;; 突變體

玉米是主要的糧食作物和飼料來(lái)源。隨著人口日益增長(zhǎng)和人們生活水平的提高, 培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)玉米新品種已成為一項(xiàng)重要任務(wù)。籽粒是糧食作物的重要性狀, 其發(fā)育狀況與玉米產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。玉米籽粒的形成為雙受精過(guò)程, 雄配子經(jīng)分裂產(chǎn)生2個(gè)精子, 其中一個(gè)與卵細(xì)胞融合形成二倍體的合子, 另一個(gè)與中央細(xì)胞的2個(gè)極核融合形成初生胚乳核。雙受精后, 合子發(fā)育成種子的二倍體的胚, 初生胚乳核發(fā)育成三倍體的胚乳。玉米胚乳發(fā)育從雄核與2個(gè)極核融合后2～4 h就開(kāi)始分裂, 首先只進(jìn)行核分裂而不進(jìn)行胞質(zhì)分裂, 在授粉的2 d里形成100多個(gè)游離核, 稱為多核體; 授粉后4 d, 胚乳細(xì)胞化, 細(xì)胞壁形成; 授粉后10 d, 細(xì)胞化結(jié)束, 進(jìn)入胚乳細(xì)胞分化增殖階段并不斷貯存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。分化的胚乳包含4個(gè)主要的細(xì)胞類型: 淀粉胚乳、糊粉層、傳遞細(xì)胞和胚周圍區(qū)域的細(xì)胞[1]。玉米胚的發(fā)育從合子的不對(duì)稱分裂開(kāi)始, 形成頂端-基部軸, 基部細(xì)胞發(fā)育成胚軸, 后成為根分生組織; 頂端細(xì)胞首先形成球狀胚, 進(jìn)入轉(zhuǎn)變期后, 分化出盾片、胚芽鞘和葉原基[2]。Clark[3]和Sheridan等[4]又把上述各時(shí)期分為3個(gè)階段。第1階段, 胚的頂?shù)撞粚?duì)稱形成并可以通過(guò)胚柄和胚基識(shí)別胚; 第2階段,輻射不對(duì)稱出現(xiàn)并且胚軸和莖尖分生組織形成; 第3階段, 胚芽和胚根的結(jié)構(gòu)越來(lái)越精細(xì), 并且休眠不斷加強(qiáng)。

種子的大小涉及種子的長(zhǎng)度、寬度及灌漿度。目前, 對(duì)于一些玉米籽粒發(fā)育突變體的研究或借助關(guān)聯(lián)分析方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控種子大小和重量的基因或性狀位點(diǎn)[5]。在玉米突變體-和-中, 谷氨酰胺合成酶(GS)的基因表達(dá)量和蛋白活性均受損傷。突變體分別表現(xiàn)為籽粒數(shù)量降低和體積變小, 雙突變體--表現(xiàn)為籽粒大小和數(shù)量同時(shí)降低。當(dāng)-在葉子中超表達(dá)時(shí), 籽粒數(shù)量增加了30%, 進(jìn)一步證明GS1-3在提高籽粒產(chǎn)量方面發(fā)揮重要作用[6]。通過(guò)連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析和表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)和-/-與種子的發(fā)育和重量密切相關(guān)[7-8]。此外, 編碼PPR蛋白的基因和等也影響了玉米種子的發(fā)育, 基因突變后, 植株籽粒變小[9-10]。編碼一個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 該基因在基底胚乳轉(zhuǎn)移層上高表達(dá), 特異地促進(jìn)糖分由母體韌皮部向籽粒的運(yùn)輸, 突變體表現(xiàn)為籽粒灌漿缺陷、成熟籽?！翱展ぁ薄⑴吆团呷樽冃11]。

玉米籽粒發(fā)育是決定產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素, 目前對(duì)其遺傳調(diào)控機(jī)制的解析還不完善。本研究以田間篩選到的玉米種子胚乳發(fā)育突變體為材料, 通過(guò)圖位克隆的方式分離到發(fā)生突變的基因?yàn)榫幋a細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶的()基因, 此突變體被命名為-, 對(duì)突變體及該基因調(diào)控籽粒發(fā)育機(jī)制的研究有助于我們更加深入地認(rèn)識(shí)籽粒發(fā)育的分子機(jī)制, 并有可能應(yīng)用到分子育種的實(shí)踐中。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用的玉米籽粒突變體-為田間發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于Lx9801和PH4CV自交后代的自然突變體, 該突變體表現(xiàn)為籽粒灌漿不充分, 成熟籽粒干癟或“空果皮”。大部分突變體-能夠正常萌發(fā)和成苗。基因定位群體為突變體-與自交系B73雜交并自交獲得的F2群體。突變體-, 其背景為W22, 為魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院李蓓老師饋贈(zèng)。

1.2 突變體表型鑒定和遺傳分析

觀察-與野生型在不同發(fā)育時(shí)期形態(tài)及籽粒的變化, 并分別選取野生型和突變體-成熟期籽粒, 用電子天平對(duì)其進(jìn)行稱重并統(tǒng)計(jì)成熟期種子的百粒重。取授粉后20 d的籽粒并投入FAA固定液(福爾馬林5 mL、50%或70%的灑精90 mL、冰醋酸5 mL)中進(jìn)行固定, 然后經(jīng)過(guò)系列乙醇脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、染色和封片, 通過(guò)顯微鏡觀察并照相, 記錄野生型和突變體-籽粒在胚乳細(xì)胞及淀粉顆粒大小和形態(tài)上的差異。對(duì)-與B73雜交得到F1代進(jìn)行自交, 獲得F2分離群體。計(jì)算F2分離群體中野生型籽粒和突變型籽粒的數(shù)目, 利用卡方測(cè)驗(yàn)進(jìn)行分離比檢驗(yàn)。

1.3 目的基因的定位

以突變體-與B73雜交構(gòu)建的F2代群體為材料, 提取F2群體突變型籽粒萌發(fā)后幼苗的DNA用于基因定位試驗(yàn)。利用MaizeGDB (https:// maizegdb.org/)和Gramene (https://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫(kù), 篩選到-與B73之間覆蓋玉米10條染色體的多態(tài)SSR (Simple Sequence Repeats)標(biāo)記, 采用BSA (Bulked Segregant Analysis)分池的方法進(jìn)行基因的粗定位。利用開(kāi)發(fā)的兩親本之間的多態(tài)InDel (Insertion-Deletion)標(biāo)記進(jìn)行基因的精細(xì)定位(表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)4%聚丙烯酰胺凝膠或3%的瓊脂糖凝膠電泳, 進(jìn)行基因型分析及交換率的計(jì)算。

1.4 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析

利用CTAB法提取玉米基因組DNA。根據(jù)玉米參考基因組B73中候選區(qū)間內(nèi)基因序列和注釋, 設(shè)計(jì)基因特異引物, 以野生型和突變體-基因組DNA為模板, 利用Phusion高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并利用Sequencher 5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)。PCR擴(kuò)增體系為: 5×Phusion buffer 10 μL、dNTPs (10 mmol L–1) 1 μL、引物(10 μmol L–1) 2.5 μL、模板DNA 2 μL、Phusion DNA聚合酶0.5 μL, 補(bǔ)超純水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為: 98℃預(yù)變性30 s; 98℃變性10 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

1.5 RNA提取及基因表達(dá)模式分析

為了檢測(cè)突變體中基因表達(dá)水平變化, 利用Trizol試劑盒提取野生型和授粉后15 d籽粒的RNA; 為了檢測(cè)基因在不同時(shí)期或不同組織的表達(dá)模式, 收集野生型玉米的幼嫩果穗(長(zhǎng)約4～5 cm)、苞葉、花絲、雄穗、旗葉及授粉后第13、15、19、23、25和29 d籽粒的胚和胚乳組織, 提取各組織RNA。電泳檢測(cè)RNA完整性并用Nanodrop 2000進(jìn)行定量。利用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA, 以cDNA為模板, 設(shè)計(jì)基因特異引物(表2), 進(jìn)行半定量RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)分析。玉米(Folylpolyglutamate synthase)基因具有較好的表達(dá)穩(wěn)定性, 因此被作為本研究的內(nèi)參基因[12]。RT-PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸15 s, 循環(huán)25 (內(nèi)參基因)或28 (基因)次; 72℃過(guò)度延伸7 min。

1.6 等位測(cè)驗(yàn)

為了檢測(cè)是否為基因等位突變體, 將與進(jìn)行雜交, 通過(guò)觀察雜交F1代及其后代籽粒表型, 確認(rèn)兩者是否為等位突變。若籽粒表現(xiàn)為突變型, 則說(shuō)明兩者為等位突變; 反之, 若表現(xiàn)為野生型, 則不是等位突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體mn1-m2的表型和遺傳分析

突變體是從玉米自交系Lx9801與PH4CV的雜交又自交多代的后代中自然突變而來(lái)。與野生型相比, 突變體苗期表現(xiàn)為植株矮小(圖1-B), 成熟期植株整體株型與野生型差別不大,但籽粒表現(xiàn)為干癟或“空果皮”, 灌漿受損(圖1-A, C)。觀察授粉后25 d的籽粒, 與野生型相比, 突變體胚和胚乳變小(圖1-D)。百粒重比較結(jié)果表明,突變籽粒的百粒重僅為野生型的21% (圖1-E), 重量顯著降低。進(jìn)一步對(duì)野生型和突變體授粉后20 d籽粒進(jìn)行石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn), 與野生型相比,胚乳細(xì)胞和淀粉顆粒均變小, 細(xì)胞排列不規(guī)則(圖2)。以上結(jié)果表明基因功能喪失后, 嚴(yán)重影響了玉米籽粒胚乳的正常生長(zhǎng)發(fā)育以及灌漿過(guò)程。

將與B73進(jìn)行雜交, 得到的F1代籽粒表現(xiàn)為野生型, 自交后得到的F2代表現(xiàn)出籽粒表型分離, 在284粒的F2群體中, 野生型籽粒為225粒, 突變體籽粒為59粒, 卡方檢測(cè)結(jié)果為χ2= 2.704, 經(jīng)查表,> 0.05, 野生型籽粒與籽粒分離比符合3∶1, 即突變體表型由單個(gè)隱性核基因突變?cè)斐伞?/p>

表1 基因定位所用的分子標(biāo)記

圖1 野生型及突變體mn1-m2表型分析

A: 野生型、雜合(+/)及純合突變體的成熟果穗, 圖中箭頭為雜合型植株自交后分離出的突變型籽粒; B: 生長(zhǎng)3周幼苗; C: 成熟期籽粒; D: 授粉后25 d籽粒的胚乳(左)和幼胚(右)的表型; E: 百粒重統(tǒng)計(jì)。A圖標(biāo)尺為5 cm, C～D圖標(biāo)尺為1 cm。

A: mature ears of wild type (WT), heterozygous (+/), and homozygous, and arrows indicate the mutant kernels segregated from ears of the heterozygous plants; B: three-week old seedlings; C: mature kernels; D: kernel endosperm and embryo of 25 days after pollination (DAP); E: statistical analysis of hundred-kernel weight. Bar: 5 cm (A) and 1 cm (C–D).

圖2 野生型及mn1-m2授粉后20 d籽粒的石蠟切片觀察

A: 授粉后20 d野生型籽粒頂部胚乳觀察; B: 授粉后20 d籽粒頂部胚乳觀察; C: 為(A)圖中紅色方框區(qū)域的放大圖; D: 為(B)圖中紅色方框區(qū)域的放大圖。A～B圖標(biāo)尺為500 μm; C～D圖標(biāo)尺為100 μm。

A: the endosperm observation of WT kernels at 20 DAP; B: the endosperm observation ofkernels at 20 DAP; C: the magnification of the area marked as red rectangle in (A); D: the magnification of the area marked as red rectangle in (B). Bar: 500 μm (A–B) and 100 μm (C–D).

2.2 mn1-m2基因定位

將突變體-與B73進(jìn)行雜交, 得到的F1代自交獲得F2代定位群體。采用BSA分池的方法尋找與-突變位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記。利用篩選到的224對(duì)均勻覆蓋玉米10條染色體的多態(tài)SSR標(biāo)記, 對(duì)-、B73、野生型基因池和突變體基因池進(jìn)行基因型分析。粗定位選用252株具有突變表型的F2單株, 發(fā)現(xiàn)第2染色體上的SSR標(biāo)記umc2249、umc2030、umc2079和umc2125與突變位點(diǎn)連鎖, 交換單株數(shù)如圖3所示, 因此初步將-定位于SSR標(biāo)記umc2030和umc2125之間。為了進(jìn)一步精細(xì)定位-基因, 在擴(kuò)大了定位F2群體的同時(shí), 開(kāi)發(fā)了新的具有多態(tài)的In-Del標(biāo)記(表1)。最終, 我們將候選基因定位于約1.1 Mb的2個(gè)InDel標(biāo)記IDP3和IDP4之間。根據(jù)MaizeGDB的注釋, 該區(qū)間含有10個(gè)候選蛋白編碼基因, 且含有典型的胚乳發(fā)育相關(guān)基因(), 又稱(), 該基因編碼胚乳特異的細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶, 在籽粒灌漿和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用, 該基因突變可致使玉米籽粒發(fā)育缺陷[13-14]。以野生型和-植株cDNA為模板, 擴(kuò)增區(qū)間內(nèi)候選基因的編碼區(qū)并進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 突變體中基因上第1個(gè)外顯子的第18個(gè)核苷酸后發(fā)生轉(zhuǎn)座子的插入, 該轉(zhuǎn)座子序列共166 bp, 其中包括8 bp的插入位點(diǎn)序列重復(fù)(target site duplication, TSD), 為CTCGTAGT。該轉(zhuǎn)座子內(nèi)部含有2個(gè)TAA終止密碼子, 因此導(dǎo)致Mn1蛋白翻譯提前終止。

圖3 mn1-m2基因的圖位克隆

利用與B73之間的多態(tài)SSR和In-Del (IDP)標(biāo)記, 通過(guò)放大定位F2群體, 結(jié)合對(duì)目標(biāo)區(qū)間內(nèi)基因測(cè)序, 最終定位到突變基因?yàn)? 編碼細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶。該基因在第1個(gè)外顯子的第18個(gè)核苷酸后發(fā)生轉(zhuǎn)座子(166 bp)的插入。圖中標(biāo)紅基因?yàn)?。黑框代表外顯子, 黑線代表內(nèi)含子。: 群體大小; Recombinants: 重組單株數(shù)。

The polymorphic SSR and In-Del (IDP) markers were developed betweenand, using the amplified F2mapping population and, sequencing of putative genes in the target region, thelocus was finally mapped to, which encodes a cell wall invertase. Antransposon (166 bp) was inserted into the first exon at 18 bp from ATG. The gene marked in red was. Black boxes represent exons and lines represent introns.: the number of individuals; Recombinants: the number of recombinants.

2.3 突變位點(diǎn)鑒定與分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)座子插入對(duì)基因表達(dá)水平的影響, 我們對(duì)野生型和突變體授粉后15 d的籽粒做了RT-PCR分析, 結(jié)果顯示, 與野生型相比, 突變體中基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖4-A)。

根據(jù)突變體中轉(zhuǎn)座子引起的插入突變, 我們開(kāi)發(fā)了基因特異的跨轉(zhuǎn)座子的In-Del標(biāo)記, 標(biāo)記引物位置如圖4-B所示。利用此In-Del標(biāo)記對(duì)野生型親本、突變體雜合植株(+/)果穗上分離出的野生型表型和突變體表型籽粒萌發(fā)后的幼苗進(jìn)行基因型鑒定, 部分結(jié)果如圖4-C所示, 野生型親本單株擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為495 bp, 突變體純合單株擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為661 bp, 而雜合植株(+/)自交后果穗上分離出的野生型籽粒表現(xiàn)出基因型的分離(+/+和+/), 因此表現(xiàn)出2種擴(kuò)增產(chǎn)物帶型。在檢測(cè)的152株雜合體自交后代分離群體中, 野生型帶型(+/+)單株39株, 雜合型帶型(+/)單株82株, 突變體帶型(/)單株31株, 符合1∶2∶1分離比(χ2= 1.789,> 0.05)。以上結(jié)果表明, 該轉(zhuǎn)座子引起的基因的插入突變與籽粒缺陷表型完全連鎖。

2.4 mn1-m2和mn1-89等位測(cè)驗(yàn)

已知-為基因的單堿基突變體, 且籽粒發(fā)育受損[15]。突變體與的突變位點(diǎn)如圖5-A所示, 以為母本, 與父本花粉進(jìn)行雜交, 雜交后代均表現(xiàn)為籽粒突變表型(圖5-B～G)。同樣以為母本, 與父本花粉進(jìn)行雜交, 雜交后代均表現(xiàn)出類似的籽粒缺陷, 無(wú)野生型籽粒表型, 因此與為等位突變體。

圖4 mn1-m2突變體中mn1基因表達(dá)水平及hAT轉(zhuǎn)座子插入的鑒定

A: 野生型及授粉后15 d籽粒中基因表達(dá)水平,為內(nèi)參基因; B: In-Del分子標(biāo)記引物P1和P2位于轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的示意圖; C: In-Del分子標(biāo)記與突變表型完全連鎖。野生型擴(kuò)增產(chǎn)物大小為495 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為661 bp。

A: the relative expression level ofin 15-DAP kernels of WT and,: reference gene; B: the schematic diagram shows that primers P1 and P2 of the developed In-Del marker flank thetransposon; C: the In-Del marker was completely linked with themutant phenotype. The length of the PCR products was 495 bp for WT, and 661 bp for. M: DNA marker DL2000.

圖5 mn1-m2與mn1-89突變體等位測(cè)驗(yàn)

A:基因結(jié)構(gòu)及2個(gè)突變體的突變位置; B: 突變體,及其雜交后代果穗的表型; C:背景野生型的籽粒; D:籽粒; E:與雜交F1代籽粒; F:籽粒; G:背景野生型W22的籽粒。B圖標(biāo)尺為5 cm, C～G圖標(biāo)尺為1 cm。

A: gene structure ofand mutant sites of the two mutants; B: the ear phenotype of mutant,and×; C: the kernels of WT for; D: the kernels of; E: the kernels of×; F: the kernels of; G: the kernels of W22. Bar: 5 cm (B) and 1 cm (C–G).

2.5 表達(dá)模式分析

分別取玉米不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的胚和胚乳, 利用半定量RT-PCR, 以為內(nèi)參基因, 檢測(cè)基因的表達(dá)模式(圖6)。結(jié)果表明,在雌穗的籽粒、苞片和花絲, 雄穗及旗葉中均有表達(dá)(圖6-A)。在授粉后各個(gè)時(shí)期的胚乳中均有表達(dá), 而胚中只在發(fā)育早期有表達(dá)(圖6-B)。的這種表達(dá)模式說(shuō)明其在雌穗和雄穗發(fā)育中均起重要作用, 且主要在籽粒胚發(fā)育早期和胚乳發(fā)育各時(shí)期發(fā)揮重要作用。

圖6 RT-PCR分析Mn1基因在玉米不同組織中的表達(dá)水平

A: 分別提取野生型玉米幼穗、苞片、花絲、雄穗和旗葉組織RNA, 檢測(cè)表達(dá)水平; B: 分別提取授粉后13、15、19、23、25和29 d籽粒的胚和胚乳RNA, 檢測(cè)表達(dá)水平。為內(nèi)參基因。

A: RNA was extracted from young ear, bract, silk, tassel, and flag leaf for detectingexpression level; B: RNA was extracted from embryo and endosperm of 13, 15, 19, 23, and 29 DAP for detectingexpression level.: the reference gene.

3 討論

玉米籽粒胚與胚乳的早期發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程, 其遺傳發(fā)育機(jī)制一直是玉米研究的熱點(diǎn)。胚作為新生植物的幼體, 其萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)自于胚乳; 胚乳占籽粒的絕大部分, 在籽粒發(fā)育過(guò)程中積累淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分。因此, 挖掘玉米籽粒胚乳發(fā)育突變體中的調(diào)控基因, 對(duì)揭示籽粒發(fā)育的分子機(jī)制以及玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的遺傳改良具有重要意義。

玉米籽粒發(fā)育缺陷突變體主要分為胚缺陷(,)、籽粒嚴(yán)重缺陷(,)以及空果皮(,)等類型[16], 本研究中突變體表現(xiàn)為籽粒灌漿不充分, 胚乳發(fā)育嚴(yán)重受阻, 成熟籽粒干癟或“空果皮”, 重量?jī)H為野生型的1/5, 因此歸屬為空果皮類型。目前, 玉米中已報(bào)道的PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白家族突變體[17]、[18]、[19]和[20], 細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶突變體[13], 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型信號(hào)肽突變體[21], 以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體[11]等, 均屬于此類。

通過(guò)圖位克隆及分子標(biāo)記連鎖驗(yàn)證發(fā)現(xiàn), 該突變表型是由于轉(zhuǎn)座子插入玉米基因致使發(fā)生無(wú)義突變所致。玉米基因是植物中第1個(gè)被解析的細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因[13-14,22], 在胚乳基底層特異表達(dá), 負(fù)責(zé)將蔗糖分解為葡萄糖和果糖, 從而維持胚乳細(xì)胞的有絲分裂活性以及養(yǎng)分從母體到子代組織的運(yùn)輸, 馬鈴薯中LIN5[23]和水稻中GIF1[24]均與Mn1高度同源且功能保守。本研究中約80%的突變體種子可以正常萌發(fā)并長(zhǎng)成為成熟植株, 推測(cè)()基因突變不致死的原因可能是因?yàn)橛衩左w內(nèi)的另外一個(gè)同源基因的存在, 在一定程度上彌補(bǔ)了功能缺失引起的胚乳發(fā)育缺陷表型[25-26]。苗期較野生型矮小, 但成熟期植株形態(tài)無(wú)明顯差別, 推測(cè)是由于萌發(fā)期胚乳供養(yǎng)不足導(dǎo)致。觀察授粉后20 d的籽粒切片發(fā)現(xiàn),-的胚乳細(xì)胞和淀粉顆粒均變小, 細(xì)胞排列不規(guī)則, 導(dǎo)致胚乳發(fā)育嚴(yán)重受阻, 與2002年報(bào)道的胚乳細(xì)胞有絲分裂活性和細(xì)胞膨大受抑制的結(jié)果相呼應(yīng)[27]。

玉米-為基因的單堿基突變體, 其突變基因編碼蛋白的C端發(fā)生一個(gè)氨基酸的變化, 致使蛋白酶活性大幅降低, 從而導(dǎo)致籽粒發(fā)育缺陷表型[15]。通過(guò)等位測(cè)驗(yàn), 對(duì)-和-雙突變體的表型觀察的結(jié)果, 進(jìn)一步驗(yàn)證了-即為基因的一個(gè)新的等位突變體。基因主要在胚乳基底層特異表達(dá), 本研究中表達(dá)模式分析的結(jié)果表明,在胚乳發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá), 進(jìn)一步說(shuō)明了其在胚乳發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的玉米籽粒發(fā)育突變體, 該突變體表現(xiàn)為灌漿缺陷, 胚和胚乳變小, 成熟籽?！翱展ぁ?。該突變體受單個(gè)隱性核基因控制。通過(guò)基因定位和基因克隆發(fā)現(xiàn),中基因在第1外顯子的第18個(gè)核苷酸后發(fā)生轉(zhuǎn)座子的插入, 導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。據(jù)此開(kāi)發(fā)的In-Del標(biāo)記與突變體表型完全連鎖, 且與為等位突變體, 由此確定是一個(gè)新的基因等位突變體。該研究完善了玉米籽粒突變體的種質(zhì)資源信息, 也為調(diào)控籽粒發(fā)育機(jī)制的解析提供新的遺傳材料。

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Characterization and genetic analysis of a new allelic mutant ofgene in maize

WANG Juan, XU Xiang-Bo, ZHANG Mao-Lin, LIU Tie-Shan, XU Qian, DONG Rui, LIU Chun-Xiao, GUAN Hai-Ying, LIU Qiang, WANG Li-Ming*, and HE Chun-Mei*

Maize Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences / National Engineering Research Center of Wheat and Maize / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Northern Yellow-Huai River Plain, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jinan 250100, Shandong, China

Grain development is a key determinant for maize grain yield and quality, but the regulatory mechanisms have not been fully revealed. A maize mutant deficient in kernel development was found and selected in our field. The mutant exhibited an incomplete grain filling, reduced embryo and endosperm size, and shriveled mature grains and empty pericarp. Genetic analysis suggested that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene. The candidate gene was preliminarily mapped to a 1.1 Mb interval on chromosome 2, and further atransposon was inserted into the first exon of() gene, which resulting in a frame-shift mutation and down-regulated expression of. The transposon insertion was fully linked to the defective kernel phenotype of the mutant, which was nominated as-. Allelism test of-and-suggested that-was a noval allelic mutant ofgene. In conclusion, we identified a new allelic mutant ofgene with different mutation site and type, which improved maize germplasm resources and provided new genetic materials for the analysis of the mechanism of Mn1 regulation on kernel development.

maize; grain filling;; mutant

2023-02-10;

2023-02-28.

10.3724/SP.J.1006.2023.23059

通信作者(Corresponding authors):汪黎明, E-mail: 13605401923@126.com; 何春梅, E-mail: chunmeihe11@163.com

E-mail: wqian456@163.com

2022-09-07;

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32101761, 31971964)和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CXGC2022A02)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32101761, 31971964) and the Agricultural Science and Technology Innovation Project of the Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2022A02).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230227.1440.010.html

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