豐姝姝,高旭杰,張珂,郭雪麗,陳雯艷,范雙雙,李國(guó)玉,王航宇*,王金輝, 2

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832002;2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江,哈爾濱 150081;3 深圳弘?yún)R醫(yī)藥科技有限公司,廣東 深圳 518000)

急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是一種急性炎癥反應(yīng)疾病,其特征是腎功能在7天或更短的時(shí)間內(nèi)突然下降,是導(dǎo)致病情進(jìn)展為慢性腎病的危險(xiǎn)因素,具有高發(fā)生率和死亡率[1]。許多病因與AKI的病理生理過(guò)程有關(guān),包括缺血再灌注損害、腎毒性藥物、內(nèi)源性毒素或感染[2-3]。近年來(lái),AKI的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)調(diào)查顯示,全世界每年大約有1300萬(wàn)急性腎損傷患者,死亡人數(shù)也達(dá)到了170萬(wàn)[4-5]。然而,迄今為止,還沒(méi)有針對(duì)AKI的特效藥物,因此,尋找有效的AKI治療方法備受關(guān)注。

山楂葉為薔薇科(Rasaceae)山楂屬(CrataegusL.)植物山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,山楂葉提取物有降糖、降脂、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[6-8]。近年來(lái),研究者們對(duì)山楂葉的關(guān)注大多集中于心血管疾病方面,但在腎損傷方面的研究很少[9-10]。周其其等[11]研究發(fā)現(xiàn)山楂葉類(lèi)黃酮可通過(guò)抗氧化和抗炎作用緩解高脂血癥造成的腎損傷。因此,本研究探討山楂葉提取物對(duì)慶大霉素所致AKI大鼠的影響及作用機(jī)制,為山楂葉治療AKI的藥用前景提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,購(gòu)自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng),體重220±20 g,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(豫)2019-0002。本實(shí)驗(yàn)由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司),TGL-16臺(tái)式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),Therrno 3001全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo),Axio Imager A蔡司正置熒光顯微鏡(北京博瑞斯科技有限公司),DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司),EC3510化學(xué)發(fā)光檢測(cè)成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

山楂葉:采集于新疆林業(yè)科學(xué)院,鹽酸維拉帕米緩釋片(1127762):AbbVie Deutschland GmbH& Co.KG,硫酸慶大霉素注射液(01Y06011 C2):宜昌人福藥業(yè),一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS,20210604)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX,20210608)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA,20210609)、總蛋白定量測(cè)定試劑盒(The total protein assay kit,20210610)、總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD,20210609)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO,20210531)、溶菌酶(Lysozyme,LZM,20210604)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl-glucosaminidase,NAG,20210416)試劑盒:南京建成生物工程研究所,P-ERK1/2抗體(BM5446):武漢博士德公司,P-p38 MAPK(4631S)、P-JNK(4668S)抗體:Cell Signaling technology公司,β-actin(TA-09)、山羊抗小鼠(127655)、山羊抗兔(129256)抗體:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山楂葉提取物的制備

干燥山楂葉分別加入10倍量與8倍量的95%乙醇進(jìn)行回流提取,每次提取時(shí)間為2 h,濾液濃縮成浸膏備用。

1.2.2 AKI動(dòng)物模型

大鼠腹腔注射慶大霉素(100 mg·kg-1),連續(xù)7 d,于末次注射24 h后,大鼠眼眶靜脈叢取血,血清測(cè)定SCR和BUN含量,然后收集大鼠24 h內(nèi)的尿液,測(cè)定LZM和NAG含量,判斷AKI模型是否建立成功。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥

將AKI大鼠隨機(jī)分為模型組,山楂葉提取物低劑量組(0.5 g·kg-1),山楂葉提取物中劑量組(1 g·kg-1),山楂葉提取物高劑量組(2 g·kg-1)及陽(yáng)性藥組(維拉帕米,15 mg·kg-1),空白組和模型組給予生理鹽水口服,其余組大鼠給予相應(yīng)藥物溶液口服,連續(xù)14 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 腎體指數(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物末次口服給藥24 h后,收集大鼠兩側(cè)腎組織,用生理鹽水沖去表面血漬,濾紙擦干,記錄重量,并計(jì)算腎體指數(shù)。

1.3.2 腎組織病理學(xué)

將固定于10%甲醛溶液48 h的腎組織浸入石蠟中,切片后,進(jìn)行HE染色,使用光學(xué)顯微鏡拍照并觀察。

1.3.3 腎功能指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物末次口服給藥24 h后,腹主動(dòng)脈取血,離心制備血清,測(cè)定SCR和BUN含量。

1.3.4 炎癥因子

取大鼠右腎適量組織剪碎,加入預(yù)冷的生理鹽水,制成10%腎組織勻漿。在4 ℃下離心得上清液,按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū),測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量。

1.3.5 氧化應(yīng)激水平

10%腎組織勻漿上清用于大鼠NO、MDA、SOD、NOS及GSH-PX含量的測(cè)定。

1.3.6 腎組織P-p38 MAPK、P-ERK、P-JNK蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解緩沖液(含0.1% PMSF)提取腎組織蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白樣品,并將目的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。經(jīng)封閉液封閉1.5 h,和P-p38(1∶800)、P-ERK(1∶1 000)、P-JNK(1∶1 000)的抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜,然后與山羊抗兔抗體孵育1.5 h,滴加ECL試劑,UVP拍照,Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠AKI模型的建立

與空白組大鼠相比,AKI大鼠尿液中LZM和NAG酶活性顯著升高(P<0.01),血清中BUN和SCR含量顯著升高(P<0.01)。表明已成功建立大鼠AKI模型(圖1)。

與空白組相比##P<0.01。圖1 AKI模型組大鼠尿液NAG、LZM水平及血清BUN、SCR水平

2.2 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎外觀和腎體指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖取材后,觀察大鼠腎組織的外觀。模型組大鼠腎臟組織明顯腫大,并且泛白,經(jīng)山楂葉提取物的處理后,腎腫大現(xiàn)象有所改善,并且顏色逐漸鮮紅。計(jì)算腎臟系數(shù),如圖2所示,與空白組相比,模型組大鼠腎臟系數(shù)升高顯著(P<0.01),山楂葉提取物呈劑量依賴性地降低這種上升趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明,山楂葉提取物能夠改善AKI大鼠腎臟的腫大情況,從而保護(hù)腎臟。

A: 空白組;B: 模型組;C: 山楂葉提取物低劑量組;D: 山楂葉提取物中劑量組;E: 山楂葉提取物高劑量組;F: 維拉帕米組;與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05。圖2 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎外觀及腎體指數(shù)的影響

2.3 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎組織損傷程度的影響

為了確定山楂葉提取物是否對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的AKI有保護(hù)作用,我們檢查了大鼠腎臟組織的病理改變,結(jié)果如圖3所示?？瞻捉M大鼠腎小管細(xì)胞擺列緊密,腎小球、腎小管形態(tài)正常;模型組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)明顯被破壞,空泡增多,腎小管擴(kuò)張,腎小管排列紊亂;與模型組相比,山楂葉提取物治療后大鼠腎損傷的組織學(xué)特征逐漸改善,其中山楂葉提取物高劑量組效果最好。

A: 空白組;B: 模型組;C: 山楂葉提取物低劑量組;D: 山楂葉提取物中劑量組;E: 山楂葉提取物高劑量組;F: 維拉帕米組。圖3 腎組織H&E染色(200×)

2.4 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠血清BUN和SCR的影響

通過(guò)測(cè)量大鼠血清BUN和SCR含量評(píng)估腎功能。結(jié)果如圖4所示,與空白組相比,模型組大鼠血清BUN和SCR含量升高,差異具有顯著性(P<0.01);與模型組相比,山楂葉提取物能呈劑量依賴性地降低BUN和SCR的含量,且中劑量和高劑量組效果顯著(P<0.05或P<0.01)。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖4 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠血清中BUN(圖A)和SCR(圖B)的影響

2.5 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的影響

AKI與全身和腎內(nèi)炎癥有關(guān),炎癥反應(yīng)會(huì)降低腎功能,并促進(jìn)晚期慢性腎病的發(fā)展。因此我們測(cè)定了炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果如圖5所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,治療組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),其中山楂葉提取物高劑量組顯著降低(P<0.01)。說(shuō)明山楂葉提取物可以降低AKI大鼠炎癥因子水平,改善腎損傷。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖5 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的影響

2.6 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎組織NO、MDA、SOD、NOS及GSH-PX含量的影響

結(jié)果如圖6所示,模型組大鼠腎組織NO、MDA、NOS含量顯著上升(P<0.01),SOD和GSH-PX含量顯著下降(P<0.01)。而山楂葉提取物治療后,與模型組大鼠比較,腎組織NO、MDA、NOS含量顯著下降(P<0.05或P<0.01),SOD和GSH-PX含量上升,高劑量組效果顯著(P<0.05或P<0.01)。因此,山楂葉提取物能夠通過(guò)抗氧化途徑來(lái)抑制AKI引起的氧化/抗氧化失衡。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖6 山楂葉提取物對(duì)AKI大鼠腎組織中NO、MDA、SOD、NOS、GSH-PX含量的影響

2.7 山楂葉提取物對(duì)大鼠腎臟P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探索山楂葉提取物在AKI中的作用機(jī)制,使用Western Blot試驗(yàn)方法對(duì)P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖7所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,山楂葉提取物組大鼠腎組織P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01),且山楂葉提取物高劑量組和陽(yáng)性藥組的蛋白表達(dá)量接近空白組。

3 討論

慶大霉素是一種強(qiáng)效氨基糖苷類(lèi)抗生素,在臨床上主要用于治療革蘭氏陰性菌感染,但因?yàn)槠淠軐?dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性,因此限制了慶大霉素的臨床應(yīng)用[12-13]。黃酮類(lèi)化合物是山楂葉中的主要成分,對(duì)肝、腎損傷及心肌缺血具有保護(hù)作用,具有極高的研究?jī)r(jià)值[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立AKI模型后給予山楂葉提取物口服給藥,以探討山楂葉提取物對(duì)慶大霉素所致AKI的影響。

慶大霉素引起的腎功能惡化表現(xiàn)為BUN和CR水平升高超過(guò)正常范圍,KIM-1和NAG的含量發(fā)生顯著變化。BUN主要經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò),BUN的升高在一定程度上可以反應(yīng)腎小球?yàn)V過(guò)功能的降低;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,注射慶大霉素7 d后的大鼠尿液NAG、LZM含量及血清BUN、SCR水平較空白組相比,均顯著性升高,提示成功建立AKI大鼠模型,這與先前的研究一致。隨后AKI大鼠給予山楂葉提取物進(jìn)行干預(yù),病理學(xué)觀察顯示,空白組大鼠腎小管、腎小球形態(tài)正常;模型組大鼠腎小管擴(kuò)張,腎組織結(jié)構(gòu)破壞,損傷嚴(yán)重,且模型組大鼠血清BUN、CR含量較空白組顯著上升;山楂葉提取物低、中、高劑量組大鼠較模型組相比,腎組織損傷有所減輕,BUN和SCR含量降低,說(shuō)明山楂葉提取物能夠改善腎組織病變,減輕慶大霉素導(dǎo)致的大鼠急性腎損傷。

氧化應(yīng)激與慶大霉素誘導(dǎo)的腎毒性的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)?；钚匝?ROS)的增加在慶大霉素引起的腎小管損傷的病理過(guò)程中扮演著重要的角色。當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)強(qiáng),不在機(jī)體的可調(diào)控范圍內(nèi)時(shí),過(guò)多的氧化物質(zhì)會(huì)蓄積,導(dǎo)致各器官發(fā)生損傷。SOD和GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)成員,對(duì)機(jī)體維持氧化平衡有重要意義;而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物,可以間接反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[15-16]。同時(shí),ROS的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)增加[17]。與空白組相比,注射慶大霉素的大鼠腎臟中的MDA水平,NO和NOS含量顯著增加,而抗氧化酶(GSH、SOD)含量顯著降低。山楂葉提取物可拮抗這些改變,表明山楂葉提取物可改善慶大霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。

先前的研究已表明MAPK通路與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)顯著相關(guān),且氧化應(yīng)激可能會(huì)誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路的激活[18-19]。因此,抑制氧化應(yīng)激和MAPK通路的藥物對(duì)AKI具有治療潛力。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑,參與調(diào)控了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理病理學(xué)過(guò)程,主要相關(guān)效應(yīng)蛋白包括p38、ERK和JNK[20]。本研究發(fā)現(xiàn),山楂葉提取物可以抑制p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平來(lái)減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而減弱慶大霉素誘導(dǎo)的炎癥損傷。

綜上所述,本研究表明山楂葉提取物能有效降低慶大霉素誘導(dǎo)的AKI大鼠的SCR和BUN水平,明顯減輕其腎臟病理?yè)p傷,通過(guò)抑制腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量來(lái)達(dá)到抗炎的作用,其保護(hù)機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激,調(diào)控MAPK信號(hào)通路,下調(diào)P-p38 MAPK、P-ERK1/2和P-JNK的表達(dá),從而減輕炎癥反應(yīng),改善腎損傷,但其具體分子作用機(jī)制需后續(xù)進(jìn)一步研究。