劉業(yè)洲，李 瑞，白 冰，崔月娜，賀 怡，陳鄔錦，孫玉萍

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830000）

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（Acute Gouty Arthritis，AGA）是因?yàn)槟蛩徕c晶體沉淀引起的一種慢性炎性風(fēng)濕病[1-2]，近年來(lái)發(fā)病率逐年增高，并呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[3-4]。該病病因可能是由于細(xì)胞外液尿酸鈉或其結(jié)晶沉淀在關(guān)節(jié)滑膜組織，引起炎癥反應(yīng)。痛風(fēng)病人的慢性炎癥會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，在急性期會(huì)加重，導(dǎo)致組織腫脹，但白細(xì)胞、CRP 等感染性指標(biāo)不會(huì)有太大的改變，一般都是通過(guò)炎性因素來(lái)衡量炎癥的嚴(yán)重程度[5]。P2X7 受體是一種雙向功能受體，在受體的第2 跨膜區(qū)上，形成一個(gè)離子通路[6]；離子的運(yùn)動(dòng)與薄膜的電壓有關(guān)，參與了炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。因此，在諸多炎癥性疾病均可檢測(cè)到其異常的表達(dá)情況能夠促進(jìn)炎性介質(zhì)如IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 等釋放。研究[7]表明，P2X7 可能激活其下游炎癥相關(guān)的通路，通過(guò)激活NLRP3復(fù)合體，招募ASC和Caspase-1前體，使其成為有活性的Caspase-1（IL-1 轉(zhuǎn)化酶），持續(xù)的ATP 刺激又可使P2X7 受體陽(yáng)離子通道轉(zhuǎn)變成非選擇性質(zhì)膜孔，便于IL-1β 釋放至細(xì)胞外發(fā)揮炎性作用[8]。本研究基于NLRP3/P2X7 受體軸探討NLRP3與P2X7 受體在痛風(fēng)中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，以期為后續(xù)的藥物研究探尋重要的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57 小鼠40 只，9 周齡，體質(zhì)量23～30 g，雄性，由新疆醫(yī)科大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0001，倫理批號(hào)：S20130418-3。試驗(yàn)前將小鼠置于（23±2）℃屏障級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)1 周，標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用水為自來(lái)水。

1.2 藥物與試劑

尿酸鈉鹽，由Sigma（美國(guó)）公司制造，戊巴比妥鈉，購(gòu)于北京源博匯科生物技術(shù)研究所。吐溫-80，Sigma（美國(guó)）公司，IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒，購(gòu)于北京欣博盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20191108；NC 薄膜，0.45 μm 孔徑，德國(guó)Sartorius 制造；牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自賽默飛（美國(guó)）公司，批號(hào)：930342；NLRP3 表達(dá)抑制劑Dapansutrile，CAS 號(hào)：54863-37-5，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；P2X7 表達(dá)抑制劑A-740003，NLRP3 激活劑，貨號(hào)：BMS-986299（compound 112），以上購(gòu)自MedChemexpress 安諾倫（北京）生物科技有限公司。一抗：NLRP3，貨號(hào)MA5-32255，稀釋度1:500，ASC，貨號(hào)PA5-50915，稀釋度1:500，Caspase-1，貨號(hào)14-9832-82，稀釋度1:500，P2X7，貨號(hào)PA5-28020，稀釋度1:500，以上均購(gòu)自賽默飛（美國(guó)）公司，IL-1β，貨號(hào)ab254360，稀釋度1:500，購(gòu)自Abcam（美國(guó)）公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

3-18K 型，冷凍型高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)；全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司；GLP-F300 型，全自動(dòng)生化分析儀，迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，CS-1200 型；電泳槽，孚約生物科技（上海）有限公司 ，通用型；電泳儀，賽默飛生物有限公司。

1.4 模型制作及分組

將單鈉尿酸鹽加入0.9%的氯化鈉注射液，再加入Twin-80（9:1），加1 mL 1.5 moL·L-1NaOH，加熱，攪拌，配制為25 mg·mL-1的尿酸鈉混合液，4℃下貯存，使用前搖勻。采用隨機(jī)數(shù)表法，將C57 小鼠分成5 組，分別為對(duì)照組（0.9%的氯化鈉注射液，8 只）、模型組（8 只）、C 組（小鼠模型鞘內(nèi)注射P2X7 抑制劑，8只）、D組（小鼠模型鞘內(nèi)注射N(xiāo)LRP3抑制劑，8只）、E 組（小鼠模型鞘內(nèi)注射P2X7 抑制劑+NLRP3 激活劑，8 只）。模型制作參照文獻(xiàn)[7]方法造模。使用0.9%氯化鈉注射液（溶解單鈉尿酸鹽）C57 小鼠足部左后外側(cè)踝部注射；以0.9%的氯化鈉注射劑作為對(duì)照組，每天1 次，連續(xù)7 d。造模組關(guān)節(jié)比健側(cè)組皮膚溫度增高、腫脹、骨骼特征消失、腳爪彎曲、四肢無(wú)力負(fù)重、行走遲緩、后腿彎曲、跛行、三足步態(tài)等。

1.5 取材與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 關(guān)節(jié)腫脹的測(cè)量 在小鼠受試踝關(guān)節(jié)處做標(biāo)記，造模后 1、6、12、24、48、72 h 采用爪腫測(cè)量?jī)x測(cè)量各組小鼠右后踝關(guān)節(jié)標(biāo)記以下的容積。關(guān)節(jié)腫脹度（mL） = （造模后踝關(guān)節(jié)容積-造模前踝關(guān)節(jié)容積）。

1.5.2 C57 小鼠炎癥因子及相關(guān)蛋白測(cè)定 4 周后，用2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1體質(zhì)量）進(jìn)行腹腔麻醉，用765 g 離心力（離心直徑8.0 cm，15 min），將上部血清吸收，-20℃保存。血清尿酸、尿素氮、肌酐的全自動(dòng)生化分析儀。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法（ELISA法）測(cè)定C57 小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量，并嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.5.3 蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織相關(guān)蛋白表達(dá)，戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉后，處死小鼠，取腳踝軟骨組織，放在1 個(gè)預(yù)冷卻的磨盤(pán)里，用液氮磨碎直到用 RIVT 分析裂解液來(lái)獲取軟骨組織，提取組織蛋白，用BCA 方法測(cè)定濃度。按照蛋白:5×Loading Buffer 比例為4:1 混合，在95℃孵育10 min。配制SDS-PAGE 凝膠，按照等體積上樣，100 V 恒壓條件下電泳100 min，此時(shí)可觀察藍(lán)色水平線進(jìn)入玻璃板的底部。PVDF 膜經(jīng)過(guò)甲醇活化后，以300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜60 min。5%脫脂奶粉封閉1 h。PVDF 膜放在提前稀釋好的一抗內(nèi)，在4 ℃過(guò)夜反應(yīng)。PVDF 膜放在二抗內(nèi)，搖床結(jié)合1 h。ECL 發(fā)光。加入封閉液稀釋的二抗溶液（稀釋濃度為1:2 000），并在室溫條件下培養(yǎng)60 min。使用PBST 清洗后，使用ECL 發(fā)光液顯影，曝光和灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單素方差分析（One-wayANOVA），多組間兩兩比較，采用方差分析；不同時(shí)間段比較，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎C57 小鼠模型腫脹度與IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)的情況

與對(duì)照組C57 小鼠的踝關(guān)節(jié)比較，C57 小鼠造模后踝關(guān)節(jié)的腫脹度顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。模型組炎癥因子表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 2 組AGA 模型C57 小鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹度比較（± s，n= 8）

表1 2 組AGA 模型C57 小鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹度比較（± s，n= 8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

組別6 h24 h48 h72 h對(duì)照組 0.12±0.04 0.15±0.03 0.11±0.03 0.12±0.04模型組 0.57±0.06# 0.76±0.14# 0.71±0.09# 0.52±0.06#

表2 2 組AGA 模型C57 小鼠踝炎癥因子表達(dá)比較（± s，n= 8）

表2 2 組AGA 模型C57 小鼠踝炎癥因子表達(dá)比較（± s，n= 8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α對(duì)照組 65.69±22.160.50±0.2315.66±3.83模型組 186.43±63.11#2.87±1.46#20.08±3.01#

2.2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達(dá)比較

與對(duì)照組C57 小鼠的踝關(guān)節(jié)比較，C57 小鼠造模后NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達(dá)比較（± s，n= 8）

表3 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎C57 小鼠模型中NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達(dá)比較（± s，n= 8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

P2X7/β-actin對(duì)照組 0.19±0.04 0.14±0.04 0.18±0.04 0.38±0.06模型組 1.31±0.07# 1.04±0.08# 1.59±0.09# 3.26±0.14#組別NLRP3/β-actin ASC/β-actin Caspase-1/β-actin

2.3 抑制NLRP3 與P2X7 表達(dá)對(duì)小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表達(dá)情況的影響

與模型組比較，抑制NLRP3 的表達(dá)，IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3 的表達(dá)降低（P＜0.05），P2X7 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與模型組比較，抑制P2X7 的表達(dá)，IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 的表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖1。

圖1 抑制NLRP3 和P2X7 表達(dá)對(duì)小鼠模型中P2X7、NLRP3 蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制NLRP3 與P2X7 表達(dá)對(duì)小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表達(dá)情況的影響（± s ，n= 8）

表4 抑制NLRP3 與P2X7 表達(dá)對(duì)小鼠模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、P2X7、NLRP3 表達(dá)情況的影響（± s ，n= 8）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-αP2X7/β-actinNLRP3/β-actin對(duì)照組 64.57±23.220.52±0.2214.55±3.890.39±0.090.93±0.05模型組189.99±45.762.99±1.5424.32±3.223.34±0.151.35±0.08 C 組104.69±32.33#1.57±0.32#18.43±3.86#3.39±0.140.37±0.06#D 組136.96±37.37#1.67±0.45#16.49±3.55#2.41±0.09#1.00±0.04#

2.4 NLRP3/P2X7 受體軸對(duì)小鼠模型相關(guān)基因表達(dá)的影響

見(jiàn)表5，表6，圖2。

圖2 NLRP3/P2X7 受體軸對(duì)模型動(dòng)物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達(dá)的影響

表5 NLRP3/P2X7 受體軸對(duì)模型動(dòng)物IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)情況比較（± s，n= 8）

表5 NLRP3/P2X7 受體軸對(duì)模型動(dòng)物IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)情況比較（± s，n= 8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

組別 IL-1βIL-6TNF-α對(duì)照組 64.57±23.220.52±0.2215.55±3.89模型組 189.99±45.76#2.99±1.54#21.32±3.22#C 組104.69±32.331.57±0.7218.43±3.62 D 組136.96±37.371.57±0.7218.99±3.55 E 組176.96±43.392.87±1.5020.44±3.67

表6 NLRP3/P2X7 受體軸對(duì)模型動(dòng)物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達(dá)的影響（± s，n= 8）

表6 NLRP3/P2X7 受體軸對(duì)模型動(dòng)物NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 表達(dá)的影響（± s，n= 8）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

P2X7/β-actin對(duì)照組 0.19±0.04 0.14±0.04 0.18±0.04 0.38±0.06模型組 1.31±0.07 1.04±0.08 1.59±0.09 3.26±0.14 C 組0.37±0.06 0.39±0.05 0.44±0.06 3.39±0.45 D 組1.00±0.06 0.64±0.05 0.74±0.07 0.41±0.09 E 組1.07±0.07# 0.92±0.06# 1.23±0.07# 3.30±0.14#組別NLRP3/β-actin ASC/β-actin Caspase-1/β-actin

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于患者嘌呤代謝能力較低，血尿酸水平增高，形成尿酸鹽，積存于關(guān)節(jié)相關(guān)軟組織，引起關(guān)節(jié)部位出現(xiàn)炎癥和病損，多發(fā)于中年男性[9]。痛風(fēng)可以喝一些低脂飲食來(lái)降低尿酸值，避免復(fù)發(fā)。痛風(fēng)的家族性、基因類(lèi)型目前的研究還不夠全面[10]，痛風(fēng)可引起關(guān)節(jié)囊、滑囊、骨質(zhì)、軟骨及其他組織的炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為高尿酸血癥、軟組織損傷及反復(fù)的關(guān)節(jié)炎，可分為急性或長(zhǎng)期，且易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起關(guān)節(jié)的腐蝕和損傷，活動(dòng)障礙合并癥、發(fā)病與促進(jìn)嗜酸性白細(xì)胞浸潤(rùn)、生成促炎細(xì)胞因子等因素相關(guān)，是一種以炎癥為特點(diǎn)的代謝性自限性疾病，尿鈉通過(guò)炎性組織液進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨，侵入關(guān)節(jié)的軟骨，造成骨質(zhì)疏松，導(dǎo)致?lián)p傷是痛風(fēng)發(fā)生的病機(jī)與重要因素[11]。近年來(lái)，隨著臨床上痛風(fēng)發(fā)病率的急劇增加，該疾病已經(jīng)引起病患家屬以及全社會(huì)的廣泛關(guān)注。隨著不同的醫(yī)學(xué)研究團(tuán)體的深入研究，痛風(fēng)的致病機(jī)理與調(diào)控機(jī)制逐步被人們認(rèn)知。本研究探討痛風(fēng)發(fā)作的分子機(jī)制，以期為后續(xù)藥物的開(kāi)發(fā)與深度理解疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。

本研究采用C57 小鼠模型進(jìn)行研究。模型動(dòng)物的炎癥因子顯著高于對(duì)照組動(dòng)物，且P2X7 與NLRP3 基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。本研究與研究[12-13]結(jié)果一致，均證實(shí)了P2X7 與NLRP3 在痛風(fēng)相關(guān)疾病中的差異表達(dá)。本研究在抑制P2X7 表達(dá)后的結(jié)果證實(shí)，小鼠模型的炎癥因子表達(dá)顯著降低，即炎癥作用顯著降低，證明P2X7高表達(dá)可能是導(dǎo)致痛風(fēng)炎癥作用的潛在分子機(jī)制之一；單獨(dú)抑制NLRP3 的表達(dá)，得到了與上述研究相類(lèi)似的結(jié)果，綜合以上結(jié)果表明，NLRP3 與P2X7的高表達(dá)可能是導(dǎo)致模型動(dòng)物炎癥的重要內(nèi)在機(jī)制，研究[14-17]均支持本研究的結(jié)論。并且，本研究結(jié)果證實(shí)了NLRP3 與P2X7 受體在模型動(dòng)物中調(diào)控作用。本研究將P2X7 的表達(dá)抑制，并同時(shí)過(guò)表達(dá)NLRP3表達(dá)，進(jìn)一步證明了P2X7 對(duì)下游NLRP3 的調(diào)控作用，證明P2X7 是通過(guò)NLRP3 進(jìn)一步發(fā)揮小鼠模型中的炎癥作用。

本研究結(jié)果證實(shí)了P2X7 受體/NLRP3 軸在調(diào)控痛風(fēng)發(fā)作小鼠模型中的潛在機(jī)制作用，并且與多個(gè)相關(guān)性研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步證實(shí)了本研究結(jié)果的可靠性。王敬博[18]研究表明青梅復(fù)方對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)作用可能是通過(guò)NLRP3 發(fā)揮作用，邢艷陽(yáng)[19]證實(shí)了NLRP3 與P2X7 在瀉濁解毒通絡(luò)法治療急性痛風(fēng)的作用機(jī)制，康佩芝[20]的研究結(jié)果表明了P2X7R/NLRP3 信號(hào)通道在痛風(fēng)清熱方對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎C57 小鼠局部組織中炎性信號(hào)表達(dá)的機(jī)制作用。以上研究結(jié)果均證實(shí)了本研究的靶點(diǎn)通路可能在后續(xù)的藥物研發(fā)和新治療方法中的潛在靶點(diǎn)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了P2X7R/NLRP3 信號(hào)通道在痛風(fēng)小鼠模型中的作用機(jī)制，為后續(xù)的藥物開(kāi)發(fā)與新型治療方法的靶點(diǎn)選擇提供了見(jiàn)解與支持。