張玉榮，李高峰，湯 彥，章美元

（復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院急診科，上海 201700）

目前，膿毒癥是一種致命性器官功能障礙綜合征，感染是引發(fā)膿毒癥的源頭，是臨床急危重患者常見病死原因之一。臨床膿毒癥患者往往存在高分解代謝和免疫紊亂，而機體免疫功能紊亂參與了膿毒癥相關性肝損傷甚至急性肝衰竭的發(fā)生與發(fā)展過程，即使有效抗生素能夠及時清除病原體，也需要免疫調節(jié)使促炎和抗炎恢復平衡，減少細胞因子風暴導致多器官功能障礙綜合征（MODS）發(fā)生，故免疫調節(jié)治療成為研究熱點[1]。目前，ω-3 多不飽和脂肪酸在膿毒癥中治療效應已得到越來越多的關注，但治療效果不一致，還存在許多不確定問題[2-3]。因此，有必要進一步研究ω-3 多不飽和脂肪酸對膿毒癥相關性的急性肝衰竭是否存在抗炎、修復等保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取BLAB/C 小鼠100 只，雌雄各半，均6～8周齡，體質量（21±2.6）g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供[許可證號：SCXK（蘇）2021-0009]。遵循有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，本研究經復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院批準（EC-C-015-A01-V03）?？瞻捉M8 只，造模后隨機分成4 組：模型組 20 只，烏司他丁組 24 只，3-PUFA 組24 只，促肝細胞生長素組24 只。各組在造模和干預治療后6、12、24 h 時間點留取標本。動物6 只，籠飼養(yǎng)，自由飲水和飲食。

1.2 動物模型制備和干預治療措施

小鼠自由飼養(yǎng)1 周，禁食1 天，自由飲水，先予以D-氨基半乳糖800 mg·kg-1（南京市生物有限公司）加脂多糖（8 mg·kg-1，批號：I4319，sigma）腹腔注射造模，隨后2 h 予以烏司他丁（0.5萬·kg-1，國藥準字：H19990134）腹腔注射，3-PUFA（0.2 g·kg-1，國藥準字：J20100092）加無菌注射10% 糖水稀釋后尾部靜脈注射，促肝細胞生長素（20 mg·kg-1，國藥準字：H20046249）腹腔注射。

1.3 血清標本采集和相關檢測

按照干預后時間點6、12、24 h 采集標本，留取靜脈血，3 000 r·min-1，離心10 min 后，分離出血清放置-70℃冰箱存放，統(tǒng)一檢測。采取ELISA檢測血清降鈣素原（PCT）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和膽堿酯酶（CHE），嚴格按照說明書操作。

1.4 肝組織標本采集

采集血清標本后，留取肝組織（生理鹽水沖洗后），肝組織放置預先留有2%甲醛溶液的標本瓶，用于做病理HE 染色觀察，另為無菌干燥瓶，分別放入組織標本，統(tǒng)一稱質量1 g，然后加入0.9%生理鹽水2 mL，制作組織均漿，4 000 r·min-1離心10 min 后，留取上清液1 mL，在 miRBase 上查尋目的基因序列，由美國Invitrogen 公司設計合成引物，提取上清液中miRNAs，合成cDNA。以U6 作為內參，在9700 型基因擴增儀中擴增 miRNAs。RT-PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10s，60℃退火60 s，共37 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT（Livak）法計算肝組織microRNA-122a 的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析處理，TN F-α、IL-6 、PCT、ALT、AST、CHE、microRNA-122a 水平等計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間、組內結果比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠變化比較

空白組小鼠表現正常飲食活躍，造模后2 h 內各組累計死亡18 只：模型組6 只，烏司他丁組4 只，3-PUFA 組5 只，促肝細胞生長素組3 只。造模后各組存活小鼠表現為體毛松散，活動明顯減少，進食量少；烏司他丁組、3-PUFA 組和促肝細胞生長素組均表現為卷曲明顯，活動減少，能夠勉強自由采食和飲水。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST 與CHE 比較

造模后6 h 后小鼠血清ALT 與AST 水平升高，CHE 水平明顯下降，且模型組與空白組的ALT、AST和CHE 水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組、烏司他丁組、促肝細胞生長素組的ALT、AST 和CHE水平比模型組明顯下降，且2 組比較，差異有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組與烏司他丁組的ALT、AST 和CHE水平比較，差異無統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組與促肝細胞生長素組的ALT、AST 比較，差異有統(tǒng)計學意義，CHE 水平差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組小鼠治療后的血清ALT、AST 與CHE 比較（± s ） U·L-1

表1 各組小鼠治療后的血清ALT、AST 與CHE 比較（± s ） U·L-1

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與促肝細胞生長素組比較，△P ＜0.05

組別時間總數/死亡數ALT AST CHE空白組8 44.0±2.3# 26.1±2.4#1 121.4±124.0#模型組3-PUFA 組烏司他丁組6 h20/6344.1±78.4 774.8±156.3256.0±25.3 12 h765.3±103.31 023.0±234.2114.2±11.3 24 h889.2±174.1#1 200.2±314.7# 75.1±3.5#6 h24/5320.4±67.2 722.1±112.5324.3±31.2 12 h314.1±63.2 564.0±113.2444.2±72.3 24 h189.4±24.6#△ 444.1±78.6#△752.1±103.2#△6 h24/4365.2±45.1 661.0±102.2345.4±19.8 12 h361.7±24.6 560.1±78.6489.2±26.7 24 h331.1±45.8# 554.2±102.3#499.4±48.3#促肝細胞生長素組6 h24/3321.3±15.4 561.1±142.3448.2±24.6 12 h156.0±21.3 479.3±75.2613.1±44.6 24 h151.3±9.2# 145.4±17.3#758.1±31.5#

2.3 各組小鼠的血清TNF-α、IL-6 與PCT 水平比較

造模后小鼠血清TNF-α、IL-6 和PCT 水平明顯升高，且模型組與空白組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組、烏司他丁組、促肝細胞生長素組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平比模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義；3-PUFA組比烏司他丁組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平更高，差異有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組與促肝細胞生長素組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平比較，差異不具有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組小鼠治療后血清TNF-α、IL-6 與PCT 水平比較（± s ） pg·mL-1

表2 各組小鼠治療后血清TNF-α、IL-6 與PCT 水平比較（± s ） pg·mL-1

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與烏司他丁組比較，△P ＜0.05

組別時間 總數/死亡數TNF-α IL-6 PCT空白組8 14.1±1.2 24.2±1.5 0.1±0.0模型組3-PUFA 組6 h20/61 556.0±191.2 663.3±86.010.2±1.5 12 h2 006.4±203.9 953.0±121.124.2±4.2 24 h3 156.3±421.0#1 022.1±115.3#57.2±9.4#6 h24/51 224.3±155.4 660.5±71.1 10.0±2.1 12 h 986.4±112.3 512.2±86.2 11.1±2.5 24 h 453.2±75.3#△ 324.1±54.6#△ 7.2±1.09#△6 h24/4 365.4±45.1 661.0±102.234.5±2.0 12 h 361.1±24.6 560.4±78.648.9±2.7 24 h 331.3±45.8# 554.2±102.3#△49.9±4.8#促肝細胞生長素組 6 h24/3 678.2±141.3 401.3±79.3 9.1±2.0 12 h 622.4±101.4 332.2±14.3 6.1±1.2 24 h 426.1±97.9# 396.4±20.1# 6.0±0.9#烏司他丁組

2.4 各組小鼠肝組織的microRNA-122a 水平比較

造模后小鼠血清microRNA-122a 水平明顯升高，且模型組與空白組的microRNA-122a 水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組、烏司他丁組、促肝細胞生長素組的microRNA-122a 水平比模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組比烏司他丁組的microRNA-122a 水平更高，差異有統(tǒng)計學意義；3-PUFA 組與促肝細胞生長素組的microRNA-122a水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表3和圖1。

圖1 各組的microRNA-122a 隨時間變化

表3 各組小鼠肝組織的microRNA-122 a 水平比較（± s ）

表3 各組小鼠肝組織的microRNA-122 a 水平比較（± s ）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與烏司他丁組比較，△P ＜0.05

組別時間 總數/死亡數 microRNA-122a空白組80.112±0.002模型組6 h20/60.515±0.072 12 h0.667±0.044 24 h0.751±0.001#△3-PUFA 組6 h24/50.322±0.056 12 h0.288±0.026 24 h0.234±0.011#烏司他丁組6 h24/40.440±0.078 12 h0.367±0.018 24 h0.304±0.023#促肝細胞生長素組6 h24/30.304±0.098 12 h0.279±0.011 24 h0.221±0.024#

2.5 各組小鼠肝組織的病理變化比較

光鏡下HE 染色觀察（40×10：放大400 倍），空白組肝組織中少量的中性粒細胞浸潤，無明顯的細胞水腫；模型組表現為在肝組織的大量漿細胞和淋巴細胞浸潤，彌漫性細胞水腫變性，肝組織切片中在匯管區(qū)尤其明顯淤血；與模型組比較，各治療組肝組織充血明顯和肝細胞水腫，漿細胞浸潤程度減輕，其中3-PUFA 組漿細胞和淋巴細胞浸潤明顯減少，促肝細胞生長素組次之，烏司他丁組居后，各組炎癥程度變化也隨著時間推移逐步減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織的病理變化比較（HE 染色，×400）

3 討論

雖然臨床采用多種免疫調節(jié)治療措施，但是膿毒癥并發(fā)急性肝衰竭的免疫狀態(tài)的調節(jié)機制網絡比較復雜，臨床病死率仍高達11.1%～40.7%[4]，其中炎癥介質釋放及免疫功能紊亂是膿毒癥內皮細胞損傷的主要因素，隨著產生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），產生過量的自由基導致氧化應激和線粒體DNA 損傷，導致線粒體功能障礙的發(fā)生，故膿毒癥相關性肝損傷甚至肝衰竭可出現在膿毒癥的各個病程階段，是發(fā)生MODS 和死亡的獨立預警危險因素[5]，膿毒癥患者早期肝功能障礙是預后不良的高危因素，盡早發(fā)現和干預膿毒癥相關性肝損傷可以改善患者預后，故如何免疫調節(jié)恢復免疫平衡是阻止膿毒癥相關肝損傷的發(fā)生發(fā)展的關鍵[6]。此外，在膿毒癥形成發(fā)展過程中由于應激消耗大量營養(yǎng)物質和炎癥介質的形成，故除病因處理之外，在治療上既需要營養(yǎng)支持又要免疫調節(jié)，既往研究提示及時予以如ω-3多不飽和脂肪酸，可以直接為機體提供能量和營養(yǎng)物質，促進內皮細胞修復，還可以具有抗微血栓、調節(jié)微循環(huán)、調控基因表達等作用，可能起到減少炎癥反應、恢復和調節(jié)免疫平衡等的治療作用，進而有助于控制感染發(fā)展，改善預后[7]。

膿毒癥相關性肝損傷已經在基因組學、表觀遺傳學、蛋白組學和代謝組學取得很大進展，但是具體病生理機制尚未完全揭示，免疫紊亂導致肝內皮細胞損傷是其主要內容，級聯(lián)瀑布樣細胞因子風暴導致多器官功能障礙發(fā)生。對于膿毒癥相關性肝損傷和急性肝功能衰竭，控制炎癥因子釋放，減少免疫介質損傷成為關鍵手段之一，故免疫營養(yǎng)治療成為必然需要且需把握給藥時機。

免疫損傷引起線粒體功能障礙常導致膿毒癥相關性肝損傷或者急性肝衰竭發(fā)生，臨床表現為肝臟是膿毒癥中能量代謝障礙發(fā)生最早、程度最嚴重的器官，在膿毒癥發(fā)生時出現微循環(huán)障礙、能量代謝障礙、氧化應激、炎癥反應、肝細胞凋亡或壞死等病理生理特點[8]。研究發(fā)現在膿毒癥相關性肝損傷甚至急性肝衰竭中，蛋白質合成功能受到影響均表現為凝血功能障礙和代謝紊亂以及膽紅素代謝受損等[9]，而且動物實驗進一步證實，膿毒癥相關性急性肝衰竭可通過AMPK 通路影響線粒體生物合成和激活線粒體自噬反應，其中肝細胞線粒體作為機體重要的能量代謝中心，在膿毒癥應激病理狀態(tài)下，肝細胞線粒體損傷可引起肝臟能量代謝和解毒功能障礙，導致急性肝功能不全，甚至發(fā)生急性肝衰竭[10-11]。因此膿毒癥相關性肝病發(fā)病機制錯綜復雜，各因素之間相互影響，目前尚無特效的治療手段[12]，加上膿毒血癥高消耗特點和免疫異常反應的特點，故目前營養(yǎng)免疫成為治療膿毒癥相關性肝病的重要輔助方法之一[13-14]。

既往研究表明，ω-3PUFA 不僅能滿足機體代謝所需的能量需求，在膿毒癥以分解代謝為主時減少白蛋白的消耗，還能促進內皮細胞膜損傷的修復，進一步影響中性粒細胞和巨噬細胞的活性，激活其細胞內酶系統(tǒng)，從而影響細胞表面受體活性變化、激素的釋放和調節(jié)基因表達，最終激活中性粒細胞、淋巴細胞以及巨噬細胞等免疫活性細胞，減少炎癥因子釋放，減少ROS 產生，改善組織微循環(huán)，起到抗微循環(huán)血栓形成等，減少花生四烯酸產生類花生酸，并減少組織炎癥，對抗白三烯來抗血小板聚集，降低細胞表面黏附因子水平等作用[15-16]，然而膿毒血癥患者補充ω-3PUFA 的獲益療效缺乏足夠證據[17]。

血清ALT、AST 是肝功能損傷早期臨床表現的指標，在反映急性肝損傷時具有很高的靈敏度及特異性，其含量常與肝細胞損傷程度成正比[18]。本實驗結果顯示，模型組小鼠血清中ALT 和AST 含量與空白組比較顯著升高，HE 染色提示肝細胞水腫、壞死和漿細胞浸潤等，而ω-3PUFA 干預組可明顯降低膿毒癥小鼠血清中ALT 和AST 含量，并改善肝臟病理變化，初步說明ω-3PUFA 對膿毒癥引發(fā)的肝損傷具有保護作用。MicroRNA-122a 是一種肝臟特異性miRNAs，在肝臟中高度表達，在維持肝細胞正常功能和緊急啟動肝細胞修復中起著十分重要的作用[19]。研究[20]表明，在腸道細胞體外培養(yǎng)實驗中，LPS 可刺激MicroRNA-122a 表達，促進TNF-a、IL-6 釋放，從而促進炎癥過度反應。本研究發(fā)現，模型組MicroRNA-122a 表達明顯升高，而3-PUFA、烏司他丁和促肝細胞生長素干預后，其表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義，由此表明，ω3-PUFA 可能存在通過下調MicroRNA-122a 表達起到抗炎和肝細胞保護作用，具體的作用通路及機制有待進一步研究。

綜上所述，營養(yǎng)與免疫的關系已經突破了營養(yǎng)缺乏、營養(yǎng)過度和營養(yǎng)失衡的范疇，從宏觀上講，營養(yǎng)與免疫的關系是相互的，營養(yǎng)是免疫的基礎。ω-3PUFA 不但提供了能量支持，減少血清白蛋白消耗，而且在減輕膿毒癥相關性肝病的全身炎癥、內毒素血癥和膿毒癥的肝外其他器官保護方面安全有效。本研究證實，ω-3PUFA 可能通過下調MicroRNA-122a 的表達，起到對急性肝衰竭起到抗炎和保護作用，而且為在膿毒癥早期就可以啟動給藥提供了實驗依據。