梁雪瑩 趙 直 龍建雄 朱路路 楊佳磊 蘇 莉

(廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣西南寧市 530021)

缺血性腦卒中是一種腦部供血障礙導(dǎo)致的腦組織壞死性疾病,約占全部腦卒中的80%,是全球死亡和殘疾的主要原因之一[1]。在時(shí)間窗內(nèi)(發(fā)病4.5 h內(nèi))盡早給予靜脈溶栓,是缺血性腦卒中的有效療法。但由于時(shí)間窗狹窄,只有不到3%的缺血性腦卒中患者可以獲得有效的溶栓治療[2-3]。因此,迫切需要尋找能夠早期診斷和有效治療缺血性腦卒中的新策略。近期研究表明,環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)參與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展[4-5],其中hsa_circ_0105035由切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組4基因(excision repair cross complementation group 4, ERCC4)前體mRNA反向剪接形成,ERCC4在修復(fù)DNA損傷和維持基因組穩(wěn)定性方面起重要作用[6]。ERCC4作為核苷酸切除修復(fù)途徑中的限速酶,可能在缺血性腦卒中的病理生理過程中起關(guān)鍵作用,其變異可能會(huì)增加缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[7],但目前尚未見有關(guān)hsa_circ_0105035與腦卒中關(guān)系的研究報(bào)道。本文旨在探討外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平與急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke, AIS)的關(guān)系,為AIS的防治策略提供新的依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) (1)病例組納入標(biāo)準(zhǔn):①缺血性腦卒中病例均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《各類腦血管病診斷要點(diǎn)》診斷標(biāo)準(zhǔn),均經(jīng)頭顱MRI和/或CT確診;②起病在72 h以內(nèi)的AIS患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①腫瘤、心源性栓塞、腦外傷、腦血管畸形等其他原因引起的AIS;②自身免疫性疾病患者;③合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙的患者;④依從性差、不合作而無法完成資料收集的患者。(2)對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):無腦卒中、冠心病等心腦血管疾病史的社區(qū)人群。排除標(biāo)準(zhǔn):①過去2周內(nèi)有感染史;②依從性差而無法完成資料收集者。

1.1.2 研究對(duì)象來源 病例組來源于2015年12月至2021年9月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科住院的AIS患者,共納入310例。對(duì)照組來源于同城區(qū)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心每年定期體檢的無腦卒中、冠心病等心腦血管疾病史的社區(qū)人群,共納入310例。病例組年齡為(65.59±11.25)歲,對(duì)照組年齡為(67.22±6.98)歲,兩組研究對(duì)象的年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有對(duì)象均知悉研究內(nèi)容,并簽署知情同意書。本研究已通過廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 外周血標(biāo)本采集與處理 利用含乙二胺四乙酸(ethylenediamintetra-acetic acid, EDTA)抗凝劑的真空采血管采集研究對(duì)象清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血5 mL,病例組為入院次日采集,4℃、2 500 g離心15 min,分離血漿后加入紅細(xì)胞裂解液(北京艾德萊生物科技有限公司)于抗凝管中,充分裂解后分裝至2 mL離心管,4℃、13 000 g離心3 min,最后獲得白細(xì)胞團(tuán),加入1 mL TRIzol試劑(美國Invitrogen公司),渦旋震蕩,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TRIzol試劑提取樣本總RNA,采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(日本TaKaRa公司),嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)說明對(duì)RNA進(jìn)行cDNA合成。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成:hsa_circ_0105035的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為ATATTTGGATACACAGGTCGGCC、TCGGTATGGTTAGAAGATATCCCAT;β-actin的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為GTGGCCGAGGACTTTGATTG、CCTGTAACAACGCATCTCATATT;GAPDH的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT、GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG;U6的上游和下游引物序列(5′ to 3′)分別為GGAACGATACAGAGAAGATTAGC、TGGAACGCTTCA-CGAATTTGCG。使用SYBR PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行PCR,然后通過Sanger測序確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的剪接序列,驗(yàn)證hsa_circ_0105035的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以2-△CT公式計(jì)算hsa_circ_0105035的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 線性消化酶(RNase R)實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證hsa_circ_0105035的環(huán)狀結(jié)構(gòu),提取的RNA分為陰性對(duì)照組(MOCK組)和RNase R消化組,RNase R消化組按照1 μg RNA加入3U RNase R溶液(美國Epicentre公司)的標(biāo)準(zhǔn)配置線性消化反應(yīng)體系,以37℃ 15 min,然后72℃ 10 min滅活酶活性,4℃ 5 min后保存收集樣本,隨后通過逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR技術(shù)測定hsa_circ_0105035和GAPDH在兩組中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) 為了明確hsa_circ_0105035的亞細(xì)胞定位情況,本研究進(jìn)行了核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)。按照PARISTM核質(zhì)分離試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)的使用說明,收集了293T細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)RNA。以U6作為細(xì)胞核定位標(biāo)志物,GAPDH作為細(xì)胞質(zhì)定位標(biāo)志物,通過qRT-PCR檢測細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中U6、GAPDH、hsa_circ_0105035的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 腦梗死體積計(jì)算 本研究通過醫(yī)院的臨床病例信息系統(tǒng)收集了AIS患者的頭顱CT、MRI影像學(xué)資料。通過Image J軟件計(jì)算得到AIS患者腦梗死部位每張CT或MRI圖像的梗死面積,每張圖像層面厚度為5 mm,最終合并計(jì)算得到腦梗死體積。

1.4 臨床血液生化指標(biāo)的檢測和分析 采用EDTA抗凝管采集AIS患者入院次日清晨的空腹外周靜脈血2 mL,使用邁瑞6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)檢測血常規(guī)指標(biāo)。采用非抗凝采血管采集患者清晨空腹外周靜脈血2 mL,使用HITACHI日立7600全自動(dòng)生化分析儀[日立(中國)有限公司]檢測心肌酶指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用R軟件(R 4.0.5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),非正態(tài)的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。所有的檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 hsa_circ_0105035的環(huán)狀結(jié)構(gòu)驗(yàn)證及亞細(xì)胞定位 將qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序,測序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物為環(huán)狀RNA hsa_circ_0105035(圖1A)。RNase R消化后,RNA核酸凝膠電泳結(jié)果(見圖1B)。線性消化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與未加RNase R組相比,hsa_circ_0105035的表達(dá)量稍有降低,而GAPDH作為線性RNA參照,表達(dá)量明顯降低(圖1C)。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hsa_circ_0105035在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),主要分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖2)。

圖1 hsa_circ_0105035環(huán)狀結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證結(jié)果

圖2 hsa_circ_0105035在細(xì)胞中的分布情況

2.2 外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平比較 AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=7.991,P<0.001),見圖3A。按性別分層分析結(jié)果顯示,男性AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平低于男性對(duì)照(Z=5.570,P<0.001),女性AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平也低于女性對(duì)照(Z=5.306,P<0.001)。見圖3B。

圖3 外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平比較

2.3 hsa_circ_0105035表達(dá)水平與AIS患者腦梗死體積的關(guān)聯(lián) 由于醫(yī)院新舊系統(tǒng)更換,本研究只收集到248例患者的頭顱CT、MRI影像學(xué)資料進(jìn)行腦梗死體積計(jì)算。按照外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平的中位數(shù),將AIS患者分為hsa_circ_0105035低表達(dá)組(n=124)和高表達(dá)組(n=124),結(jié)果顯示,與hsa_circ_0105035低表達(dá)組AIS患者相比,hsa_circ_0105035高表達(dá)組AIS患者的腦梗死體積更小(Z=2.293,P=0.022),見圖4A。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,AIS患者的外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平與腦梗死體積呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.127,P=0.045),見圖4B。3例不同hsa_circ_0105035表達(dá)和腦梗死體積的AIS患者數(shù)據(jù)見圖5。

圖4 AIS患者外周血hsa_circ_0105035表達(dá)水平與腦梗死體積的關(guān)聯(lián)

圖5 3例AIS患者h(yuǎn)sa_circ_0105035表達(dá)水平和腦梗死體積的代表性數(shù)據(jù)

2.4 hsa_circ_0105035不同表達(dá)水平AIS患者的臨床指標(biāo)比較 hsa_circ_0105035低表達(dá)組AIS患者的血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶含量高于高表達(dá)組,而紅細(xì)胞體積分布寬度低于高表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。兩組AIS患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)等血常規(guī)指標(biāo)及肌酸激酶、MB亞型肌酸激酶同工酶、α-羥丁酸脫氨酶比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1、表2。

表1 hsa_circ_0105035不同表達(dá)水平的AIS患者血常規(guī)指標(biāo)比較 (x±s)

表2 hsa_circ_0105035不同表達(dá)水平AIS患者的心肌酶指標(biāo)比較 (x±s,U/L)

3 討 論

近年來,缺血性腦卒中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,造成了嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因而迫切需要探尋缺血性腦卒中的有效防治手段[8]。本研究首次報(bào)道hsa_circ_0105035在AIS患者外周血中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)水平與腦梗死體積呈負(fù)相關(guān),而且與血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶等參數(shù)相關(guān),為AIS的病情評(píng)估和疾病預(yù)測提供潛在的參考價(jià)值。

circRNA是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴的閉合環(huán)狀RNA分子[9],這一特質(zhì)使得circRNA能夠耐受線性RNA消化酶的消化,具有更高的穩(wěn)定性和更長的半衰期[10]。本研究通過線性RNA消化酶實(shí)驗(yàn)觀察到hsa_circ_0105035的表達(dá)穩(wěn)定性明顯高于線性RNA,并通過PCR產(chǎn)物測序明確引物的特異性以及對(duì)hsa_circ_0105035的特異性擴(kuò)增。我們最終證實(shí)hsa_circ_0105035是一個(gè)環(huán)狀RNA分子,為后續(xù)研究的開展提供了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕A(chǔ)。我們還通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)明確了hsa_circ_0105035主要分布于細(xì)胞質(zhì),為后續(xù)功能和機(jī)制的研究指明了探索的方向。

近年研究發(fā)現(xiàn),circRNAs在哺乳動(dòng)物大腦組織中的表達(dá)豐度遠(yuǎn)高于其他組織,circRNAs可能參與缺血性腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[11]。Jiang等[12]報(bào)道缺氧缺血性腦損傷后大鼠海馬體中circRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。另有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)的circFOXP1能減輕小鼠神經(jīng)功能缺損和縮小腦梗死體積,并通過調(diào)節(jié)STAT3/凋亡信號(hào)來緩解腦缺血后的腦損傷[13]。近年研究表明,circRNAs與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)circTLK1在小鼠缺血性腦組織和AIS患者血漿中表達(dá)升高,并且敲低circTLK1能夠減少缺血性神經(jīng)元損傷、改善神經(jīng)功能缺損。Peng等[15]報(bào)道,circRNA HECTD1的表達(dá)與AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度和復(fù)發(fā)相關(guān)。但有關(guān)hsa_circ_0105035與缺血性腦卒中關(guān)系的研究尚未見報(bào)道,值得我們?nèi)ヌ剿骱脱芯?。hsa_circ_0105035是由ERCC4基因反向剪接形成的環(huán)狀RNA。本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0105035在AIS患者外周血中表達(dá)下調(diào),提示其可能影響AIS的發(fā)生發(fā)展。缺血性腦卒中發(fā)生后不久,會(huì)在大腦的多種細(xì)胞中引起DNA氧化損傷,同時(shí)細(xì)胞也會(huì)通過誘導(dǎo)內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制來對(duì)抗DNA損傷的積累,其中就包括核苷酸切除修復(fù)途徑[16]。有研究發(fā)現(xiàn),ERCC4是核苷酸切除修復(fù)途徑中必不可少的基因[17]。ERCC4作為核心的DNA核苷酸切除修復(fù)酶,在發(fā)生DNA氧化損傷后被激活,從而參與DNA損傷修復(fù)過程[18-19]。有研究報(bào)道大鼠腦缺血/再灌注后缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡與DNA修復(fù)酶活性下降有關(guān)[20]。何偉[21]也發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)基因XRCC1 rs25487位點(diǎn)A等位基因可能是中國南方漢族人群缺血性腦卒中發(fā)病的獨(dú)立保護(hù)因素。Ma等[7]發(fā)現(xiàn),ERCC4基因可能在缺血性腦卒中的病理生理過程中發(fā)揮重要作用,其變異可能會(huì)增加缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。另有研究[22]報(bào)道,circRNA可以促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)化為肽,我們推測hsa_circ_0105035是否可以通過調(diào)控其親本基因ERCC4來參與缺血性腦卒中的病理生理過程,這有待于下一步的探索。

AIS患者的腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損程度是判斷病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo),腦梗死體積較大者更容易發(fā)生偏癱、意識(shí)障礙,甚至危及生命[23-24]。在疾病早期盡快判斷AIS患者腦梗死體積有助于臨床制訂個(gè)體化的診療方案,改善患者病情。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種破壞性機(jī)制是引起神經(jīng)元損傷的原因[25]。在腦卒中患者中,神經(jīng)元損傷與腦梗死體積相關(guān),能夠縮小腦梗死體積的治療通常也能夠減輕神經(jīng)元損傷[26-27]。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn),circTLK1在AIS患者血漿中表達(dá)上調(diào),與腦梗死體積呈正相關(guān)關(guān)系;在小鼠腦卒中模型中敲低circTLK1可顯著縮小腦梗死體積,減輕神經(jīng)元損傷。Li等[28]觀察到大動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性腦卒中患者外周血的hsa_circ_0001599表達(dá)上調(diào),與腦梗死體積呈正相關(guān)。Yang等[5]發(fā)現(xiàn)circUSP36在缺血性腦卒中患者外周血中顯著降低,其表達(dá)水平與腦梗死體積呈負(fù)相關(guān)。與上述研究一致。本研究也發(fā)現(xiàn)在AIS患者外周血hsa_circ_0105035水平與腦梗死體積呈負(fù)相關(guān)。目前缺血性腦卒中的診斷主要依靠影像學(xué)檢查,但卒中往往在初始發(fā)作時(shí)無法識(shí)別,MRI可能無法發(fā)現(xiàn)AIS患者潛在或微小的梗死病變。我們的研究發(fā)現(xiàn)可以為缺血性腦卒中早期的病情評(píng)估和疾病預(yù)測提供潛在的參考價(jià)值。

此外,circRNA還被報(bào)道與AIS相關(guān)的多種臨床特征存在相關(guān)性[29]。在AIS患者中,表達(dá)上調(diào)的circHECTD1與C反應(yīng)蛋白和多個(gè)促炎細(xì)胞因子水平呈正相關(guān)[15]。而AIS患者外周血中表達(dá)下調(diào)的circDLGAP4與C反應(yīng)蛋白水平和多個(gè)促炎細(xì)胞因子水平呈負(fù)相關(guān)[30]。一般來說,在患者中表達(dá)上調(diào)的circRNA是疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素,并與部分疾病促進(jìn)因子呈正相關(guān),而在患者中表達(dá)下調(diào)的circRNA則相反。我們的研究也發(fā)現(xiàn)在hsa_circ_0105035高表達(dá)組AIS患者中血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶含量降低。此前已有報(bào)道,血小板體積分布寬度可能參與了AIS的發(fā)生發(fā)展過程,并對(duì)疾病的嚴(yán)重程度有一定的影響[31]。臨床研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦卒中患者的血小板體積分布寬度越大,病情越嚴(yán)重[32-33]。臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者的血清和腦脊液中乳酸脫氫酶水平升高,與腦卒中發(fā)生有關(guān)[34]。還有研究發(fā)現(xiàn)急性腦卒中患者的腦脊液乳酸脫氫酶水平可以反映腦損傷的嚴(yán)重程度[35]。hsa_circ_0105035與血小板體積分布寬度、乳酸脫氫酶的關(guān)聯(lián)也進(jìn)一步表明了hsa_circ_0105035可能作為一個(gè)保護(hù)因素在AIS病理生理過程中發(fā)揮作用。

綜上所述,我們首次揭示hsa_circ_0105035可能與AIS的發(fā)生相關(guān),并且與AIS患者的腦梗死體積存在關(guān)聯(lián),可以為缺血性腦卒中早期的病情評(píng)估和疾病監(jiān)測提供潛在的預(yù)測價(jià)值。本研究僅采集了AIS患者入院次日的血液樣本,并未收集治療后的樣本以比較hsa_circ_0105035的表達(dá)差異對(duì)腦梗死體積及病情嚴(yán)重程度的影響,這也是我們未來的研究可以進(jìn)一步探索的方向,從而促進(jìn)缺血性腦卒中防治。