劉娟娟 鄭嬌 高成林 劉虹杉 張東華 劉麗

摘要：【目的】從蘋(píng)果不同部位內(nèi)生真菌中篩選具有促生潛力的菌株，為開(kāi)發(fā)蘋(píng)果益生真菌儲(chǔ)備菌種資源，為探究蘋(píng)果內(nèi)生真菌與宿主互利共生關(guān)系提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。【方法】采用組織分離法獲得內(nèi)生真菌，基于ITS 序列鑒定到屬種；篩選、比較菌株產(chǎn)IAA、鐵載體等促生能力；回接潛力菌株于蘋(píng)果組培苗，50 d 后觀察組培苗生長(zhǎng)情況。【結(jié)果】共分離獲得內(nèi)生真菌51 株鑒定為29 種。促生潛力篩選后，選取IAA 含量高、兼具促生功能多的5 株菌（LG06、PG06、LG12、LY09、PJ09）回接蘋(píng)果組培苗。結(jié)果表明其中4 株內(nèi)生真菌對(duì)蘋(píng)果組培苗的促生效果明顯，與對(duì)照相比，菌株P(guān)G06 的葉片數(shù)量、葉綠素含量、葉片總氮含量增高最多（p＜0.05），依次增加了61.17%、44.08%、42.56%。【結(jié)論】蘋(píng)果內(nèi)生真菌PG06、LG12、LG06、LY09 對(duì)蘋(píng)果組培苗均具有顯著促生作用，可進(jìn)一步探索田間試驗(yàn)。研究為蘋(píng)果生物肥料的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蘋(píng)果；內(nèi)生真菌；促生；組培苗

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）04-0735-12

蘋(píng)果（Malus pumila Mill.）是屬于薔薇科蘋(píng)果屬的落葉喬木，是我國(guó)第一大水果[1]。在蘋(píng)果栽培中，常通過(guò)施用大量的化肥以提高其生產(chǎn)力，這不僅無(wú)法保證蘋(píng)果的產(chǎn)量和質(zhì)量，還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境影響[2]。生物肥料是微生物的活細(xì)胞，能為植物提供營(yíng)養(yǎng)、控制病害，同時(shí)還能改良土壤，是化肥的最佳替代品[3]。利用植物微生物開(kāi)發(fā)生物菌肥可實(shí)現(xiàn)減肥增效的直觀效果，從而促進(jìn)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

植物及植物微生物共同構(gòu)成了一個(gè)協(xié)調(diào)互作的單元，稱(chēng)為植物全功能體[4]。在長(zhǎng)期的互作過(guò)程中，與植物緊密結(jié)合的微生物與微生物之間很可能也會(huì)進(jìn)化出群落水平的互作策略，使它們能夠在植物全功能體內(nèi)持續(xù)存在，并在植物生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5]。植物內(nèi)生真菌是指其生活史中一定階段或全部階段生活于健康植物組織內(nèi)部對(duì)植物無(wú)害的微生物。相比根際微生物（菌根真菌、共生菌或根圍真菌），內(nèi)生真菌在時(shí)間和空間上都存在優(yōu)先權(quán)，它生活在植物組織內(nèi)部可免受溫度、滲透勢(shì)和紫外線輻射等不利外部環(huán)境因素的影響[6-7]。其中，內(nèi)生真菌為絲狀生長(zhǎng)，接觸面積大，生物量大，可分解糖類(lèi)、單寧等多種有機(jī)物，參與腐殖質(zhì)的形成和分解、氨化作用和硝化作用等，因而對(duì)植物促生長(zhǎng)、環(huán)境修復(fù)方面的效果優(yōu)于內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌[8-10]。由內(nèi)生真菌制成的生物肥具有生物環(huán)境安全性和使土壤質(zhì)量提高、保持生態(tài)平衡等特點(diǎn)，更適用于農(nóng)業(yè)傳統(tǒng)栽培系統(tǒng)[11]。

內(nèi)生真菌對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的有益作用已有很好的證明，如內(nèi)生真菌能產(chǎn)生生物控制劑、植物激素（吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素等）、能產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物鐵載體、水解酶等，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。此外，內(nèi)生真菌還能夠改善土壤，并促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的運(yùn)輸[7]。侯姣姣等[14]從古國(guó)槐葉片內(nèi)分離篩選解磷內(nèi)生真菌，回接后可侵染宿主無(wú)菌苗根部組織，建立共生關(guān)系，并影響宿主的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、相關(guān)防御酶活性等。Turbat 等[15]從苦參中分離出15 種內(nèi)生真菌，篩選菌株的間接或直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力，并進(jìn)行體外評(píng)估。目前針對(duì)蘋(píng)果內(nèi)生真菌，大多學(xué)者以分離鑒定為基礎(chǔ)，篩選蘋(píng)果重要病害如蘋(píng)果腐爛病[16-18]、炭疽病[19]、輪紋病[20]等的內(nèi)生生防真菌。Liu 等[21]也對(duì)蘋(píng)果內(nèi)生真菌的群落多樣性進(jìn)行研究，表明受組織類(lèi)型、品種和地點(diǎn)的影響，內(nèi)生真菌的種類(lèi)不同。但對(duì)蘋(píng)果內(nèi)生真菌的促生功能菌株研究方面還屬空白。筆者在本研究中從紅富士蘋(píng)果不同組織部位分離內(nèi)生真菌，并研究其產(chǎn)IAA、鐵載體、溶磷、解鉀、固氮等促生功能，為蘋(píng)果的可持續(xù)栽培提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

分離材料采自于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園紅富士蘋(píng)果樹(shù)（砧木為八棱海棠Malus robusta Rehder）的根、枝、葉，蘋(píng)果樹(shù)齡為15 年。供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基[22]、LB培養(yǎng)基、Kings B培養(yǎng)基、溶解無(wú)機(jī)磷（NPA）培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、MAS-CAS 瓊脂培養(yǎng)基、阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基[23-25]。

1.2 內(nèi)生真菌的分離及鑒定

取紅富士蘋(píng)果樹(shù)的根、枝、葉，用自來(lái)水沖洗干凈，自然風(fēng)干后剝離枝和根韌皮部，將根、枝、葉置于75%酒精中表面消毒30 s，5%的次氯酸鈉溶液中浸泡（根4 min、枝3 min、葉2 min），最后無(wú)菌水中漂洗4 次，每次至少1 min。之后用滅菌濾紙吸干水分并剪成1 cm×1 cm 的小塊，分別置于PDA、LB 和孟加拉紅培養(yǎng)基，每皿放3 塊，每處理3 個(gè)重復(fù)。取最后一次漂洗用的無(wú)菌水涂抹于PDA平板，對(duì)組織表面消毒效果進(jìn)行驗(yàn)證。置于26 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)兩周左右長(zhǎng)出菌絲，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化，4 ℃低溫斜面試管保存菌種。

內(nèi)生真菌的鑒定：①形態(tài)學(xué)鑒定：內(nèi)生真菌鑒定參考《真菌鑒定手冊(cè)》[26]來(lái)進(jìn)行初步的鑒定分析；②分子生物學(xué)鑒定：使用生工的Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，按照試劑盒步驟提取內(nèi)生真菌菌株DNA，用引物ITS4（5- TCCTCCGCTTATTGATATG-3）和ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）PCR 擴(kuò)增菌株DNA 的ITS 序列。

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 2 μL、ITS4 和ITS5 各1.5 μL、Mixs 25 μL、ddH2O 20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；56 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min；共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保溫。PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)及測(cè)序：把提取的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后將PCR產(chǎn)物送至擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，將ITS 數(shù)據(jù)序列通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定菌株分類(lèi)地位。

1.3 內(nèi)生真菌促生功能篩選

1.3.1 分泌吲哚乙酸（IAA）能力測(cè)定 ①定性分析：采用Salkowski 比色法[27]，將菌株分別接種到含誘導(dǎo)物色氨酸和不含色氨酸的Kings B培養(yǎng)液中，于28 ℃搖床培養(yǎng)7 d 進(jìn)行液體發(fā)酵，設(shè)3 次重復(fù)，取2 mL發(fā)酵液，12 000 r ·min-1離心15 min，取1 mL上清液置于離心管中，加入等量氯化鐵比色液，于暗處?kù)o置30 min，觀察其顏色是否出現(xiàn)變化以及顏色的變化情況。

② 定量分析：以標(biāo)品IAA 配制0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg·L-1的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液，按上述顯色方法，使用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將①中的顯色菌株置于紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)530 nm處測(cè)OD值，代入方程中計(jì)算出菌株產(chǎn)吲哚乙酸的量。

1.3.2 產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定采用MAS-CAS 檢測(cè)法[28]，將待測(cè)菌株的菌絲接種于CAS 瓊脂培養(yǎng)基上，在黑暗條件下28 ℃培養(yǎng)7 d。通過(guò)觀察CAS瓊脂上真菌菌落周?chē)念伾兓瘉?lái)確定是否具有產(chǎn)載體能力，菌落在平板有橙黃色帶包圍的認(rèn)為是產(chǎn)鐵載體的菌株。以未接種的CAS為對(duì)照，每株菌測(cè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 溶磷解鉀能力測(cè)定 （1）溶磷。①定性檢測(cè)：將待測(cè)菌株用打孔器（d=5 mm）截取菌餅接種至無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基（NPA）和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株設(shè)置3 次重復(fù)，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。根據(jù)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）大小定性判斷該菌株是否具有溶磷能力。

②定量測(cè)定：采用鉬銻抗比色法[29]測(cè)定培養(yǎng)液中有效磷含量。用打孔器（d=5 mm）截取菌餅接種至蒙金娜液體培養(yǎng)基中，每個(gè)處理組設(shè)置3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫?fù)u床、150 r · min-1振蕩培養(yǎng)7 d，將培養(yǎng)液于10 000 r ·min-1離心15 min，用紫外分光光度計(jì)在880 nm 處比色并測(cè)定OD 值，以此判斷菌株對(duì)有機(jī)磷的溶解能力，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株有效磷含量。有效磷含量計(jì)算公式如下：

AP=（P×V×Ts）/V0。

式中：P為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查的磷濃度；V為顯色時(shí)定容體積；Ts分取倍數(shù)；V0為測(cè)定發(fā)酵液的體積；AP為有效磷含量。

（2）解鉀。將待測(cè)菌株接種至解鉀培養(yǎng)基上，3次重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱26 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落周邊是否會(huì)形成透明圈，將透明圈作為參考指標(biāo)篩選出具有解鉀活性的菌株。

1.3.4 固氮能力測(cè)定 將活化好的待測(cè)菌株接種于阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)7 d，連續(xù)繼代培養(yǎng)3 次，若菌株在Ashby培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，則表明該菌株具有固氮活性。

1.4 內(nèi)生真菌對(duì)組培苗的促生作用

將蘋(píng)果組培苗（紅富士）培養(yǎng)7 d 觀察無(wú)污染后，用打孔器打取5 mm×5 mm的菌餅接種于組培苗根部，每一株苗3 塊菌餅，設(shè)5 個(gè)重復(fù)，以空白組培苗為對(duì)照。在組培瓶中培養(yǎng)50 d 后取蘋(píng)果組培苗根、莖、葉，用自來(lái)水沖洗干凈，置于20% KOH 水溶液中90 ℃水浴10～30 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后用5%醋酸進(jìn)行酸化，再滴加入墨水染色5～10 min，用清水脫色后即可鏡檢。同時(shí)對(duì)蘋(píng)果組培苗進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定，用直尺測(cè)量組培苗的株高及根長(zhǎng)；采用葉綠素測(cè)定儀測(cè)定組培苗葉綠素和葉總氮含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Photoshop、Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表處理，采用SPSS 26.0 軟件對(duì)不同處理間的差異進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離鑒定

對(duì)15 年生紅富士蘋(píng)果樹(shù)的根、枝、葉，采用PDA、LB、孟加拉紅3 種培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，共分離獲得87 株內(nèi)生真菌。通過(guò)形態(tài)學(xué)初步鑒定后選取51 株真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將51 株真菌歸類(lèi)為1 門(mén)4 綱8 目16 科21 屬29 種，比對(duì)相似度均在97%以上。其中菌株LJ03、LJ08 與已知菌種的相似度低于90%，疑為新種（表1）。

其中，PDA 培養(yǎng)基上共分離出13 株，鑒定為9屬10 種，占分離鑒定的26%；LB 上共分離出16 株，鑒定為7 屬9 種

加色氨酸的菌株P(guān)G06 分泌IAA能力最強(qiáng)，分泌量高達(dá)（90.85±2.77）μg·mL-1，與其他菌株存在顯著性差異（p＜0.05），其次是菌株P(guān)J09，分泌量（26.55±3.26）μg·mL-1，菌株MJ10 分泌IAA 能力最弱，分泌量（14.62±1.69）μg·mL-1。不加色氨酸的菌株MJ09產(chǎn)IAA 分泌量最高，為（13.17±1.56）μg ·mL-1，其次是菌株P(guān)J09，分泌量（12.47±2.31）μg·mL-1。最低是菌株P(guān)Y03，分泌量只有（6.55±0.04）μg·mL-1。其中，含色氨酸分泌量最高的菌株來(lái)源于根部，不含色氨酸分泌量最高的菌株來(lái)源于枝部。枝部菌株P(guān)J09不論是在含色氨酸或不含色氨酸中都呈現(xiàn)了較高的分泌量（圖1）。

2.2.2 產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定 將菌株接種于CAS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察菌落在平板上是否有橙黃色帶包圍，有則認(rèn)為菌株具產(chǎn)鐵載體能力（圖2）。29 株內(nèi)生菌中10 株具有產(chǎn)鐵載體的能力。其中，菌株P(guān)J09、MJ10、MJ01、MJ03、MJ07、LJ03 來(lái)源于枝部，菌株LG06、LG12 來(lái)源于根部，菌株P(guān)Y10、LY03 來(lái)源于葉部。

2.2.3 溶磷解鉀能力測(cè)定 對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的定性測(cè)定，沒(méi)有檢測(cè)到溶無(wú)機(jī)磷功能的菌株，其中有3 株內(nèi)生真菌能在有機(jī)磷培養(yǎng)基上形成透明溶磷圈（圖3），D/d 比值范圍在1.21～1.44。由于D/d 值的大小與菌株自身代謝產(chǎn)物酶種類(lèi)、酸種類(lèi)及其釋放快慢等相關(guān)，因此為了避免誤差，透明圈法只能作為溶磷菌的初步篩選指標(biāo)，菌株需進(jìn)一步進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩，才能準(zhǔn)確掌握溶磷能力的大小。

進(jìn)一步用鉬銻比色法判定菌株的解磷能力。根據(jù)公式計(jì)算得出菌株LG06 有效磷含量最高，達(dá)66.27 mg·mL-1，其次為PG10，磷含量20.01 mg·mL-1，菌株P(guān)G06含量最低只有3.30 mg·mL（-1 表2）。依據(jù)有效磷含量可判斷菌株LG06 溶磷能力最強(qiáng)。在對(duì)29 株內(nèi)生真菌解鉀功能檢測(cè)中，并未檢測(cè)到其解鉀能力。

2.2.4 固氮能力測(cè)定 將29 株內(nèi)生真菌接種于無(wú)氮Ashby 固體培養(yǎng)基上。有26 株內(nèi)生真菌能正常生長(zhǎng)且生長(zhǎng)狀況良好，表明這26 株內(nèi)生真菌具有固氮能力，其中PJ08 和PY03 在菌株邊緣形成了透明圈，這表示菌株還可分解Ashby 培養(yǎng)基內(nèi)的難溶化合物CaCO3 （圖4）。

2.2.5 內(nèi)生真菌對(duì)蘋(píng)果組培苗的促生驗(yàn)證 依據(jù)IAA分泌量選取LG06、LG12、PG06、PJ09、LY09 共5株內(nèi)生真菌進(jìn)行組培苗回接實(shí)驗(yàn)。在組培瓶里培養(yǎng)50 d，回接菌株P(guān)J09 的組培苗全部死亡，其余均可正常生長(zhǎng)。其中，回接PG06 和LG12 菌株的組培苗成活率達(dá)100%，LG06 成活率為60%，LY09 成活率為40%。在定殖檢測(cè)中，顯微鏡下可在蘋(píng)果根的韌皮部觀察到內(nèi)生真菌，菌絲進(jìn)入根表皮層，并沿縱軸延伸，具有可見(jiàn)的細(xì)胞間菌絲體形態(tài)，這表明菌株均在組培苗中定殖成功（圖5）。

對(duì)回接處理的蘋(píng)果組培苗進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明與CK 相比，處理組葉片數(shù)量、葉綠素、葉片總氮含量存在顯著差異（p＜0.05），而株高和根長(zhǎng)無(wú)顯著性差異。處理菌株LY09 株高值最高，較對(duì)照提高了46.31%，LG06 根長(zhǎng)值最大，較對(duì)照提高了67.77%。菌株P(guān)G06 葉片數(shù)量、葉綠素含量、葉片總氮含量較對(duì)照差異最為顯著，依次增加了61.17%、44.08%、42.56%；其次為菌株LG12，葉綠素含量、葉片總氮含量較對(duì)照增加了42.92%、40.67%。這表明IAA 分泌量高的蘋(píng)果促生內(nèi)生真菌可以增加蘋(píng)果的葉綠素含量，而葉綠素含量的增加會(huì)增強(qiáng)蘋(píng)果的光合作用，進(jìn)而促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)（圖6、表3）。

3 討論

筆者在本研究中對(duì)蘋(píng)果植株內(nèi)生真菌進(jìn)行促生功能研究，共分離獲得內(nèi)生真菌51 株鑒定為29種。研究結(jié)果表明，孟加拉紅培養(yǎng)基分離獲得的蘋(píng)果內(nèi)生真菌種類(lèi)多于PDA培養(yǎng)基，這與徐濤[30]的結(jié)果一致；不同組織部位分離的結(jié)果顯示，蘋(píng)果枝部獲得內(nèi)生真菌種類(lèi)最多，王萬(wàn)周[31]也曾證明蘋(píng)果枝部可培養(yǎng)內(nèi)生真菌種類(lèi)比根和葉部更豐富。本研究根部獲得的優(yōu)勢(shì)屬為叢赤殼科的Dactylonectria 屬，而鄧振山等[19]從紅富士根部分離得到的優(yōu)勢(shì)屬為鏈格孢屬（Alternaria），這可能與分離的季節(jié)、樹(shù)齡或栽培區(qū)域有關(guān)。但徐濤[30]、李芳等[32]、王亞紅等[33]從蘋(píng)果枝條獲得的枝孢屬（Cladosporium）、間座殼屬（Diaporthe）、黑孢屬（Nigrospora）、毛殼菌屬（Chaetomium）、節(jié)菱孢屬（Arthrinium）等都與本文菌屬一致，這表明相同的植物宿主中內(nèi)生真菌的種類(lèi)存在相似性。

IAA 是刺激細(xì)胞分裂、促進(jìn)植物根系形成和增加生長(zhǎng)量的植物激素。本次實(shí)驗(yàn)中篩選的內(nèi)生真菌，含色氨酸時(shí)各菌株產(chǎn)IAA 的量在14.62～90.85 μg ·mL-1；不含色氨酸時(shí)各菌株產(chǎn)IAA的量在6.55～13.17 μg·mL-1。在植物中，吲哚乙酸可由色氨酸前體（TRP）通過(guò)各種途徑產(chǎn)生，多數(shù)研究者證明色氨酸介導(dǎo)下更適合IAA 的產(chǎn)生與合成[34-36]。Shah等[37]對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究表明所有菌株都能合成IAA，在添加色氨酸后菌株R10 產(chǎn)IAA 量接近60 μg ·mL-1。在喬木中，閩楠內(nèi)生真菌加色氨酸后IAA 含量最高達(dá)41.39 μg · mL- 1 [27]，杜仲內(nèi)生真菌IAA 含量最高達(dá)38 mg·mL-1 [38]，本研究蘋(píng)果內(nèi)生真菌加色氨酸后IAA 分泌量最高達(dá)90.85 μg·mL-1，處于相對(duì)較高的水平。

鐵載體是可以螯合土壤中游離鐵的低分子量化合物，是微生物代謝的重要分子，可以作為各種酶的輔助因子，抑制病原微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本研究中篩選出具有產(chǎn)生鐵載體能力的內(nèi)生真菌10 株，其中間座殼屬（Diaporthe）有3 株都具有產(chǎn)鐵能力，菊芋內(nèi)生真菌的間座殼屬菌株也表明具有產(chǎn)鐵載體能力[12]。菌株P(guān)J09 為鏈格孢屬（Alternaria），Turbat 等[15]從苦參內(nèi)生真菌中也篩選到鏈格孢屬菌株具有產(chǎn)鐵能力。菌株MJ01 為青霉屬（Penicillium），馮美茹[23]在百花曼陀內(nèi)生真菌中篩選到青霉屬具有產(chǎn)鐵能力。另5 株分別為L(zhǎng)G06 Dactylonectriaalcacerensis、LG12 球毛殼菌（Chaetomium globosum）、PY10 Neosetophoma rosigena、LY03 Anastomitrabeculiadidymospora、MJ03 巴西擬隱盤(pán)孢菌（Paraconiothyrium brasiliense），尚沒(méi)有關(guān)于其產(chǎn)鐵載體能力的報(bào)道。

本次實(shí)驗(yàn)中并未篩選到溶解無(wú)機(jī)磷能力的菌株，但從根部篩選到3 株具有溶解有機(jī)磷能力的菌株。其中LG06 Dactylonectria alcacerensis 解有機(jī)磷能力達(dá)66.27 mg·mL-1，其次為PG10 Thelonectriablackeriella 達(dá)20.01 mg·mL-1。馬韋韋[39]對(duì)野生延胡索內(nèi)生真菌進(jìn)行解有機(jī)磷能力篩選，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生真菌簡(jiǎn)青霉（Penicillium asturianum）和米曲霉（Aspergillusoryzae）有解有機(jī)磷能力。徐潤(rùn)冰[40]發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌H88-2c（Argyranthemum apiacea）具有解有機(jī)磷能力，且高達(dá)134.40 mg·L-1，本次篩選出的菌株與其相比解有機(jī)磷能力較低。

植物內(nèi)生固氮菌是指定殖在植物內(nèi)部與宿主聯(lián)合固氮的菌，是植物內(nèi)生菌中最受關(guān)注的類(lèi)群之一[41]。對(duì)于內(nèi)生固氮菌種類(lèi)的研究目前主要集中于細(xì)菌，內(nèi)生真菌的固氮能力還有待探索。馮美茹[23]對(duì)百花曼陀羅內(nèi)生真菌的固氮研究發(fā)現(xiàn)，其分離的全部菌株都可在阿須貝氏培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。在本研究中共有29 株內(nèi)生真菌，有26 株可在無(wú)氮培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。可見(jiàn)植物內(nèi)生真菌也是開(kāi)發(fā)固氮內(nèi)生菌不容忽視的重要菌源。

為了進(jìn)一步探究蘋(píng)果內(nèi)生真菌與苗木間的互利共生關(guān)系，選取IAA 含量高、兼具促生功能多的菌株回接至蘋(píng)果組培苗，觀察其對(duì)組培苗的生長(zhǎng)影響。結(jié)果表明除PJ09 菌株外其余4 株內(nèi)生真菌對(duì)蘋(píng)果組培苗的促生效果明顯。其中，菌株LG06 分離率達(dá)21%，是較有優(yōu)勢(shì)的蘋(píng)果內(nèi)生真菌，同時(shí)兼具有產(chǎn)IAA、鐵載體、固氮和溶解有機(jī)磷能力，顯示出了良好的促生潛力，回接蘋(píng)果組培苗后也表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。菌株P(guān)G06 為粉紅粘帚霉（Clonostachysrosea f. catenulata），分泌IAA 能力最強(qiáng)，分泌量達(dá)（90.85±2.77）μg·mL-1，同時(shí)兼具2 種促生特性。粉紅粘帚霉作為一種重要的植物內(nèi)生真菌，因其具有強(qiáng)大的破壞力，成為很多植物病原真菌的克星，如葡萄孢菌、草莓灰霉菌等，是目前極具潛力的生防菌之一[42]。菌株LG12 為球毛殼菌（Chaetomiumglobosum），可產(chǎn)IAA、鐵載體和固氮。該屬?gòu)V泛分布于空氣、土壤等多種自然環(huán)境中，也是植物最常見(jiàn)的內(nèi)生真菌之一。球毛殼菌能產(chǎn)生種類(lèi)繁多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗真菌和殺線蟲(chóng)等多種生物活性，對(duì)植物病原真菌和根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）有較大的生物防治潛力[43]。

以上菌株豐富了蘋(píng)果內(nèi)生促生菌資源，為開(kāi)發(fā)蘋(píng)果內(nèi)生真菌生物菌肥提供了理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。以上菌株的內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物、多樣性及生物防治功能篩選等，將是未來(lái)進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

從蘋(píng)果植株根、枝、葉分離獲得內(nèi)生真菌51 株鑒定為29 種。對(duì)促生潛力篩選發(fā)現(xiàn)，29 株菌均有不同程度的產(chǎn)IAA能力，10 株具有產(chǎn)鐵載體功能，3 株具有解有機(jī)磷能力，26 株具有固氮能力，29 株均不具有解鉀能力。選取IAA 含量高、兼具促生功能多的5 株菌回接蘋(píng)果組培苗，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌PG06、LG12、LG06、LY09 對(duì)組培苗均具有顯著促生作用。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所董雅鳳老師為本試驗(yàn)提供蘋(píng)果組培苗。

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