王金銘，張如春,2，趙德輝，蔡熙姮，劉晗璐,3※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.赤峰學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

腹瀉是臨床上較為常見的癥狀之一，通?？梢杂伤幬?、細(xì)菌和病毒等因素所導(dǎo)致。一般感染性的腹瀉如細(xì)菌感染、病毒感染可以使用抗生素進(jìn)行治療，但是對(duì)于抗生素的使用存在較大的爭議。近年來，微生物組學(xué)的研究表明，過度使用、長期使用、不正確使用抗生素以及抗生素的機(jī)械特性可能會(huì)引起抗生素相關(guān)性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea, AAD）。AAD 被定義為與抗生素聯(lián)合發(fā)生的不明原因腹瀉[1]，同時(shí)導(dǎo)致一些不良的后果，包括腸道菌群紊亂、假膜性結(jié)腸炎等。AAD的機(jī)制尚不明確，但目前認(rèn)為主要是由于腸道微生物群落的破壞以及隨后碳水化合物、短鏈脂肪酸和膽汁酸代謝的變化而導(dǎo)致的滲透性腹瀉并對(duì)病原體的抵抗能力下降所導(dǎo)致[2]。2019 年國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194 號(hào)公告，我國飼料中全面禁止添加抗生素，以減少濫用抗生素造成的危害，維護(hù)動(dòng)物源食品安全和公共衛(wèi)生安全，因此尋找新的止瀉策略成為研究的焦點(diǎn)。

益生菌被世界衛(wèi)生組織定義為活的、非致病性的微生物，攝入后對(duì)宿主的健康和生理產(chǎn)生積極的影響[3]。在過去的幾十年中，益生菌對(duì)人和動(dòng)物健康的有益作用在文獻(xiàn)中被大量報(bào)道。研究證明了益生菌對(duì)多種炎癥的輔助治療效果，如關(guān)節(jié)炎[4,5]、結(jié)膜炎[6]、濕疹[7]和胃腸炎[8]等，其中最重要的就是對(duì)炎癥性腸病的預(yù)防及治療效果，同時(shí)許多研究證實(shí)了內(nèi)源性益生菌在胃腸道疾病中的預(yù)防及治療作用。益生菌主要的機(jī)制包括能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)[9]、能夠與病原菌競爭性抑制[10]及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能[11]等，其作用機(jī)制也在被逐步揭示。目前大部分益生菌改善腸道健康的共同機(jī)制是益生菌可以防止或抑制病原體的增殖，抑制病原體產(chǎn)生毒力因子，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，減輕腸道炎癥，從而減少后續(xù)的感染。近年來，許多研究表明，酵母菌[12]、芽孢桿菌[12]、乳桿菌[13]、雙歧桿菌[13]、片球菌、鏈球菌和放線菌等多種細(xì)菌都可以作為益生菌材料，并且乳桿菌被認(rèn)為是最有潛力的益生菌。已有文獻(xiàn)報(bào)道羅伊氏乳桿菌對(duì)動(dòng)物[8]和人[14]具有止瀉的作用如JIRI HRDY 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌5454 和動(dòng)物雙歧桿菌5764 改善了三硝基苯磺酸和嚙齒枸櫞酸桿菌引起的小鼠結(jié)腸炎。URBANSKA 等[16]在進(jìn)行一項(xiàng)羅伊氏乳桿菌17938（L.reuteri17938）治療兒童各類腹瀉病的療效的研究中發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌17938 可縮短腹瀉的持續(xù)時(shí)間并增加治愈的機(jī)會(huì)。CHEN 等[17]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌可顯著預(yù)防仔豬大腸桿菌感染引起的腹瀉。目前，動(dòng)物用益生菌大部分分離于禽類、豬及牛等反芻動(dòng)物和水產(chǎn)動(dòng)物的胃腸道內(nèi)容物或排泄物，還有一部分來源于土壤、海洋等環(huán)境和植物、發(fā)酵食品[18]。本試驗(yàn)采用從健康藍(lán)狐腸道分離獲得的羅伊氏乳桿菌，研究其對(duì)不同類型腹瀉的預(yù)防及治療作用，以期為益生菌資源的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)材料及科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株及制備 羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri ZJF036 由本實(shí)驗(yàn)室自健康藍(lán)狐腸道中分離、鑒定及保藏；沙門氏菌Salmonella typhimurium ATCC 14028 購于中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 2~4 周齡健康SPF 級(jí)雌性SD 大鼠，購自長春生物制品研究所有限責(zé)任公司；所有大鼠專人飼養(yǎng)，預(yù)飼期7 d，飼喂常規(guī)大鼠日糧，自由采食、飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì) 80 只大鼠隨機(jī)分為10 組。具體分為正常對(duì)照組（NC）、DSS 誘導(dǎo)的腹瀉對(duì)照組（DSSC）、DSS誘導(dǎo)腹瀉治療組（DSS1）和預(yù)防組（DSS2）、沙門氏菌腹瀉對(duì)照組（STMC）、沙門氏菌腹瀉治療組（STM1）和預(yù)防組（STM2）、慶大霉素和頭孢拉定相關(guān)性腹瀉對(duì)照組（GCC）、乳酸菌對(duì)慶大霉素和頭孢拉定相關(guān)性腹瀉治療組（GC1）和預(yù)防組（GC2）。

DSS 誘導(dǎo)腹瀉方法：將DSS 粉末配置成2% 的DSS溶液[19]，自由飲用7 d。沙門氏菌感染誘導(dǎo)腹瀉方法：將沙門氏菌發(fā)酵液（1 108CFU/mL）按照每天1 mL/只的用量連續(xù)灌胃7 d[20]?？股叵嚓P(guān)性腹瀉誘導(dǎo)方法：慶大霉素（2 mL，8 萬U/支），頭孢拉定膠囊，用無菌生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為62.5 g/L 的抗生素混合液[21]1 mL/只。將羅伊氏乳桿菌ZJF036 發(fā)酵液（1 108CFU/mL）按照每天1 mL/只的用量連續(xù)灌胃進(jìn)行治療或預(yù)防。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見圖1。

圖1 大鼠分組及灌胃情況Fig.1 Grouping and gavage of rats

1.2.2 總增重 試驗(yàn)周期為21 d，分別于試驗(yàn)第0 d、7 d、14 d 和21 d 對(duì)所有試驗(yàn)大鼠進(jìn)行稱重，觀察比較不同組大鼠的生長情況，繪制總增重圖。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物處理及樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束，將全部試驗(yàn)大鼠戊巴比妥鈉麻醉，眼球采血后頸椎脫臼處死[22]。采集的血液用于酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA）測定血清中細(xì)胞因子水平。

1.2.4 血清中細(xì)胞因子水平的測定 促凝采血管收集的血液樣本，離心（3 000 r/min、10 min、4 ℃）后收集血清，80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA 法根據(jù)酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的ELISA 試劑盒說明書中的操作步驟測定大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12與TNF- 水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行整理后采用SAS中的單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)差異顯著性，試驗(yàn)結(jié)果用平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）來表示，其中P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異，同時(shí)用GraphPad Prism 8 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌對(duì)各組大鼠總增重的影響

如圖2 所示，圖2 A 為DSS 處理各組0~21 d 大鼠總增重情況，與DSSC 組相比DSS2 組總增重顯著增高（P ＜0.05）。圖2 B 為沙門氏菌處理各組0~21 d大鼠總增重情況，與STMC 組相比STM1、STM2 組大鼠總增重顯著增加（P ＜0.05）；圖2 C 為GEN ＋CE 處理各組0~21 d 大鼠總增重情況，GC1 和GC2組大鼠總增重與GCC 組相比沒有顯著差異。說明羅伊氏乳桿菌灌服后對(duì)沙門氏菌感染以及DSS 誘導(dǎo)的大鼠體重下降有一定的抑制作用，并且預(yù)防作用要大于治療作用。

圖2 各組大鼠0~21 d 總增重Fig.2 Weight gain of rats in 0-21 days

2.2 羅伊氏乳桿菌DSS誘導(dǎo)腹瀉大鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)的影響

采用ELISA 試劑盒對(duì)各組大鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和TNF- 5 個(gè)細(xì)胞因子水平進(jìn)行測定。DSS 組測定結(jié)果如下圖3，與DSSC 組相比，DSS2組大鼠血清中IL-2、TNF- 和IL-4 的水平顯著降低（P ＜0.05），DSS1 組大鼠血清中IL-12、TNF- 的水平顯著降低（P ＜0.05）。

圖3 DSS 組大鼠血清中（A）IL-2、（B）IL-4、（C）IL-10、（D）IL-12 和（E）TNF- 的水平Fig.3 The levels of(A)IL-2,(B)IL-4,(C)IL-10,(D)IL-12 and(E)TNF- in serum of rats in DSS group

2.3 羅伊氏乳桿菌沙門氏菌誘導(dǎo)腹瀉大鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)的影響

沙門氏菌組測定結(jié)果如下圖4，與STMC組相比，STM1 組大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12 和TNF- 的水平顯著降低（P ＜0.05），STM2 組大鼠血清中IL-12的水平顯著降低（P ＜0.05）。

圖4 沙門氏菌組大鼠血清中（A）IL-2、（B）IL-4、（C）IL-10、（D）IL-12 和（E）TNF- 的水平Fig.4 The levels of(A)IL-2,(B)IL-4,(C)IL-10,(D)IL-12 and(E)TNF- in serum of rats in salmonella group

2.4 羅伊氏乳桿菌慶大霉素＋頭孢拉定誘導(dǎo)腹瀉大鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)的影響

GEN+CE 處理組測定結(jié)果如下圖5，與GCC 組相比，GC1、GC2 組大鼠血清中IL-2、IL-12 的水平顯著降低（P ＜0.05），GC1 組大鼠血清中IL-10 的水平顯著提高。GC1 與GC2 對(duì)大鼠血清中IL-4 和TNF-的水平?jīng)]有顯著影響。

圖5 GEN+CE 組大鼠血清中（A）IL-2、（B）IL-4、（C）IL-10、（D）IL-12 和（E）TNF- 的水平Fig.5 The levels of(A)IL-2,(B)IL-4,(C)IL-10,(D)IL-12 and(E)TNF- in serum of rats in GEN+CE group

3 討論

DSS 常用作誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis,UC）模型，UC 是一種病因不明的直腸和結(jié)腸炎性疾病，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)血性腹瀉、體重減輕、精神沉郁及被毛雜亂等癥狀[23]。潰瘍性結(jié)腸炎導(dǎo)致的長期腹瀉可引起水電解質(zhì)紊亂和酸堿平衡失調(diào)，影響動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而使體重減輕。目前益生菌制劑常用于各類腹瀉或腸炎的輔助治療。益生菌的調(diào)節(jié)機(jī)制也是多因素的，包括調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)腸道屏障功能及調(diào)節(jié)宿主 微生物穩(wěn)態(tài)等。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌ZJF036 具有良好的益生作用，如耐酸、耐膽鹽、耐人工胃腸液、對(duì)腸上皮細(xì)胞有較好的黏附能力以及對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌等致病菌的體外抑制作用等[24]。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)會(huì)調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的增加，同時(shí)激發(fā)機(jī)體的免疫，調(diào)節(jié)抗炎因子的分泌，進(jìn)而維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。目前已發(fā)現(xiàn)與UC 疾病相關(guān)的細(xì)胞因子涉及白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和干擾素等[25]。IL-2 是一種控制T 細(xì)胞增殖和分化、維持Treg 細(xì)胞和NK 細(xì)胞激活的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子[26]。研究表明敲除小鼠IL-2 基因后可引起小鼠IBD 說明IL-2 在鼠腸炎中起重要作用同時(shí)對(duì)腸道免疫穩(wěn)態(tài)有調(diào)節(jié)作用[27]，IL-2 還可誘導(dǎo)2 型淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子10[28]。IL-4、IL-10 具有免疫調(diào)節(jié)作用，主要是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，并且可以抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用，下調(diào)促炎因子的表達(dá)和分泌，減輕組織損傷程度，抑制炎癥的發(fā)展進(jìn)程[29]。腫瘤壞死因子 是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，能通過刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)而加速細(xì)胞的增殖，促進(jìn)單核細(xì)胞等分泌炎性細(xì)胞因子進(jìn)而導(dǎo)致腸道組織受損[30]。在本研究中，探究了羅伊氏乳桿菌ZJF036 在DSS 誘導(dǎo)大鼠腹瀉中的作用。結(jié)果顯示羅伊氏乳桿菌ZJF036 預(yù)防處理DSS 誘導(dǎo)的腹瀉大鼠可顯著緩解大鼠體重下降，說明羅伊氏乳桿菌ZJF036 預(yù)防處理可減輕DSS 引起的腸道炎癥，這與鄭雨星[31]研究結(jié)果一致。這一結(jié)果可能與羅伊氏乳桿菌參與對(duì)腸道屏障功能的維護(hù)及改善了造模引起的腸道菌群多樣性降低有關(guān)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)與DSS 對(duì)照組相比羅伊氏乳桿菌預(yù)防處理和治療處理分別顯著降低了DSS 誘導(dǎo)的腹瀉大鼠血清中IL-2 和IL-12 的水平，且顯著降低了TNF- 的水平，提高了大鼠血清中IL-10 的水平，說明經(jīng)羅伊氏乳桿菌ZJF036可減少炎癥因子的生成在調(diào)節(jié)和維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)方面有一定的作用。

沙門氏菌是禽類養(yǎng)殖中常見的致病菌，該菌可通過口服被污染的食物和水源等獲得，可在多種動(dòng)物宿主中引起腸炎、腹瀉、發(fā)熱及生長性能低下等。益生菌是一種替代抗生素的添加劑，用于防止或減少養(yǎng)殖中病原體的感染。據(jù)報(bào)道，許多乳酸桿菌產(chǎn)生的物質(zhì)具有抗沙門氏菌的抗菌活性[32]。羅伊氏乳桿菌ZJF036 預(yù)防處理和治療處理沙門氏菌感染的腹瀉大鼠，可顯著緩解大鼠體重下降，并且預(yù)防組大鼠體重增重顯著高于正常對(duì)照組，說明預(yù)防的效果要好于治療的效果。M.NAKPHAICHI等[33]和石水琴[34]研究表明羅伊氏乳桿菌能穩(wěn)定定植在雞腸道內(nèi)同時(shí)降低腸道pH，從而顯著降低沙門氏菌在雞腸道內(nèi)的定植和復(fù)制。沙門氏菌穿過腸道屏障后被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，其在體內(nèi)的感染涉及Th1 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子中IFN- 是較強(qiáng)大的防御之一，而IL-12 能誘導(dǎo)其產(chǎn)生[35]。羅伊氏乳桿菌預(yù)防處理和治療處理沙門氏菌感染的腹瀉大鼠都顯著降低了血清中促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-12 及TNF- 的水平，增加了抗炎細(xì)胞因子IL-4 的水平，提示大鼠腸道免疫穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。石水琴[34]研究結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌在雞消化系統(tǒng)的各個(gè)腸段內(nèi)均有定殖，主要位于結(jié)腸和盲腸，并且可促進(jìn)雞腸道屏障的緊密連接和腸上皮細(xì)胞的完整性，改善腸道屏障功能。

抗生素相關(guān)性腹瀉是抗生素使用的常見并發(fā)癥，可破壞腸道菌群平衡，輕度表現(xiàn)在排便次數(shù)及糞便形態(tài)上的變化，重度則是由艱難梭菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的大量繁殖引起的假膜性結(jié)腸炎、胃腸功能衰竭等臨床表現(xiàn)[36]。本試驗(yàn)結(jié)果羅伊氏乳桿菌ZJF036對(duì)GEN+CE 誘導(dǎo)的腹瀉大鼠體重沒有顯著的影響。與GEN+CE 對(duì)照組相比，羅伊氏乳桿菌預(yù)防處理和治療處理都顯著降低了大鼠血清中IL-2、IL-12和TNF-的水平。說明羅伊氏乳桿菌的治療處理和預(yù)防處理都能顯著緩解GEN+CE 誘導(dǎo)的大鼠抗生素相關(guān)性腹瀉程度并提高IL-10 水平和降低IL-2、IL-12 和TNF-的水平來改善腸道炎癥情況及黏膜屏障的功能，在大鼠腹瀉過程中起到保護(hù)作用。Lorenzo Drago 等[37]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌LRE02 與鼠李糖乳桿菌LR04 兩種益生菌的混合物計(jì)量為每天1.2 109CFU 持續(xù)30 d可以降低兒童（1 月至18 歲）AAD 的發(fā)生率、腹瀉天數(shù)改善糞便性狀。M.KOLODZIEJ[38]的研究在隨機(jī)、雙盲及安慰劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，沒有發(fā)現(xiàn)108CFU/mL 的羅伊氏乳桿菌對(duì)口服或者靜脈注射抗生素治療的18 歲以下兒童腹瀉有效。所以推測羅伊氏乳桿菌ZJF036 對(duì)慶大霉素和頭孢拉定誘導(dǎo)的腹瀉大鼠總增重沒有顯著的作用可能與益生菌使用劑量、菌種來源、菌株特異性和持續(xù)時(shí)間等差異有關(guān)[36]。其對(duì)于抗生素相關(guān)性腹瀉的影響及機(jī)制未來還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，藍(lán)狐源羅伊氏乳桿菌ZJF036 對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎引起的腹瀉、沙門氏菌感染引起的腹瀉和抗生素相關(guān)性腹瀉有一定的防治效果，能緩解由不同原因引起的大鼠腸道炎癥、調(diào)節(jié)抗炎細(xì)胞因子和促炎細(xì)胞因子水平從而維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。