周進(jìn)國，白麗梅

（1.邯鄲市第一醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000；2.邯鄲市第一醫(yī)院東區(qū)急診內(nèi)科，河北 邯鄲 056000）

丙泊酚具備促使神經(jīng)元無序凋亡、抑制增殖等神經(jīng)毒性，過量使用可引起海馬組織損傷，并誘發(fā)認(rèn)知功能障礙[1]。神經(jīng)炎癥、缺血再灌注損傷、氧自由基超載和TNF- /NF- B炎性因子異常激活等導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡被公認(rèn)為海馬損傷病理過程的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制[2]，因此抑制缺血再灌注損傷及阻滯TNF- /NF- B 炎性因子表達(dá)成為治療及預(yù)防丙泊酚麻醉損傷導(dǎo)致神經(jīng)元受損保護(hù)的思路之一。

澤蘭植物為唇形科地筍屬植物毛葉地瓜兒苗（Lycopus lucidus Turcz.var. hirtus Regel）及地瓜兒苗（Lycopus lucidus Turcz.）莖上植物部分，毛葉地瓜兒苗的莖、苗、花和葉部分被收錄于2010 年版《中國藥典》（一部），被廣泛用于活血調(diào)經(jīng)，祛瘀消癰，利水消腫等方面；現(xiàn)代藥理藥學(xué)認(rèn)為其具備抗凝血、活血化瘀、增加膽汁含量、熊去氧膽酸量、清除二苯代苦味酰肼和超氧陰離子自由基能力、兼具還原Fe3+能力及抑制脂質(zhì)過氧化能力[3]。

研究表明，澤蘭提取物具備調(diào)控PI3K/Akt 信號通路，下調(diào)HIF-1a 基因表達(dá)及其下游蛋白表達(dá)[4]，有效緩解急性缺氧導(dǎo)致的局灶性腦組織缺血損傷[5]，澤蘭素可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而在丙泊酚麻醉損傷后腦神經(jīng)保護(hù)與TNF- /NF- B 通路間的調(diào)節(jié)關(guān)系尚未被完全闡釋。因此，該研究擬建立丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的小鼠海馬組織損傷模型，解析澤蘭素對丙泊酚誘導(dǎo)的C57 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷及TNF- /NF- B 信號通路的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物準(zhǔn)備

SPF 級健康C57 小鼠，體質(zhì)量35.0~70.0 g，購自北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SYXK（京）2021-006。喂養(yǎng)環(huán)境：溫度22.0~25.0 ℃，濕度45.0%~60.0%，光照12 h/陰暗12 h 循環(huán)。

1.2 試驗(yàn)耗材及儀器

澤蘭素水提物532-48-9（CAS：YT70340，濃度為10.0%）購自北京伊塔生物科技有限公司；3-N-丁苯酞6066-49-5（貨號：ESSMB00312, CAS：6066-49-5，規(guī)格：100mg）購自香港吉斯恩貝國際貿(mào)易有限公司；Mouse TNF- ELISA Kit [小鼠腫瘤壞死因子（TNF- ）ELISA 試劑盒（貨號：70-EK282/3）]購自聯(lián)科生物；小鼠核因子B 亞基p65（NF- B p65）ELISA 試劑盒（批號：EK-R37440）購自上海酶研生物科技有限公司；BDNF ELISA 試劑盒（批號：l110740）購自上海貝諾生物科技有限公司。

奧盛Feyond-A300 多功能酶聯(lián)免疫分析儀（杭州奧盛）；Chemi-Doc XRS 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi Doc XRS+，BIO-RAD）。

1.3 試驗(yàn)方法

C57 成年小鼠60 只隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分組，丁苯酞陽性藥物對照組（Dl-3-N-Butylphthalide，丁苯酞組，n=40）、澤蘭素給藥組（澤蘭素組，n=40）和海馬損傷模型組（模型組，n=40），通過50 mg/kg丙泊酚腹腔旋轉(zhuǎn)注射方式誘導(dǎo)C57 成年小鼠海馬組織腦損傷模型，依據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[4]的造模成功標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)鼠全部成功制備丙泊酚誘導(dǎo)海馬損傷模型。另選取同批次小鼠作為空白對照組（空白組，n=40）。丁苯酞組、澤蘭素組、模型組和空白組以腹腔旋轉(zhuǎn)注射方式分別給予2 mg/kg丁苯酞、1.24 mL/kg 自備澤蘭素混懸液1 mL、0.9%生理鹽水1 mL和0.9%生理鹽水1 mL，1 次/d，持續(xù)28 d。第29 天采用頸動脈脫臼法處死全部試驗(yàn)小鼠，剝離雙側(cè)腦實(shí)質(zhì)組織，參照Shi 的方法[6]，ELISA 方法檢測干預(yù)前及試驗(yàn)開始第28 天測定腦實(shí)質(zhì)的TNF- /NF- B、BDNF 表達(dá)。

HE 染色，取試驗(yàn)鼠雙側(cè)腦實(shí)質(zhì)組織于10.0%福爾馬林液體中行酒精脫水、石蠟包埋，冠狀切面取片，選擇典型海馬組織切片行脫蠟、水化及Nissl 染色液浸染30 min 后漂洗，100%pH=7.030 中性樹膠后封閉10 min 后行纖維切片。

各組小鼠干預(yù)前、試驗(yàn)開始第28 天分別行水迷宮試驗(yàn)、神經(jīng)功能評分和糖水偏好試驗(yàn)。水迷宮試驗(yàn)，設(shè)置室內(nèi)平均噪聲數(shù)低于25 分貝，隨機(jī)選取4 處不同象限等間隔池壁入水點(diǎn)，各組小鼠分別獨(dú)立依次從入水點(diǎn)放置，記錄3 min內(nèi)平臺尋找時間、靜置平臺穿越頻次，訓(xùn)練4 d，每天2 次，限定時間為2 min，訓(xùn)練間隔10min，記錄逃避潛伏時長、對側(cè)象限停留時間（s）和穿越初始平臺頻次。神經(jīng)功能評分：依據(jù)Masso Shmiizu-Sasamata評價方法，在干預(yù)前、試驗(yàn)開始第28天兩個時間節(jié)點(diǎn)依據(jù)動物神經(jīng)行為記錄神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評分。糖水偏好試驗(yàn)：在規(guī)定時間節(jié)點(diǎn)內(nèi)對試驗(yàn)小鼠進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)，分別給予每只試驗(yàn)小鼠1 瓶無菌蒸餾水和1 瓶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%蔗糖溶液，24 h 后分別計算無菌蒸餾水及蔗糖溶液減少質(zhì)量，統(tǒng)計小鼠糖水偏好指標(biāo)。糖水偏好指標(biāo)= 蔗糖水減少量/（蔗糖水減少量+無菌蒸餾水減少量） 100%。

1.4 觀察指標(biāo)

Nissl染色法檢測大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷程度；神經(jīng)功能評分、Morris 水迷宮試驗(yàn)和糖水偏好試驗(yàn)3種試驗(yàn)方式檢測干預(yù)前后神經(jīng) 行為變化；ELISA 方法比較TNF- /NF- B、BNDF 水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方案

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，雙尾檢驗(yàn)，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷

澤蘭素組、丁苯酞組和空白組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對完整，邊緣界限明確清晰，神經(jīng)元突觸圓潤飽滿，細(xì)胞核位于中央；模型組損傷處神經(jīng)元皺起，邊緣界限不清，組織紋理及結(jié)構(gòu)紊亂，見圖1。

圖1 海馬組織切片形態(tài)圖（HE 染色，200 ）Fig.1 Morphological map of hippocampal tissue sections (HE staining,200 )

圖2 各組糖水偏好試驗(yàn)指數(shù)變化百分比Fig.2 Percentage change in sugar preference test index by group

2.2 各組干預(yù)前后水迷宮試驗(yàn)指標(biāo)變化

Morris水迷宮結(jié)果提示：與空白組比較，模型組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著延長（P＜0.05）；澤蘭素組、丁苯酞組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著縮短（P ＜0.05）。模型組穿越初始平臺頻次顯著減少，澤蘭素組、丁苯酞組顯著增加（P ＜0.05）。與模型組比較，澤蘭素組、丁苯酞組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著縮短、穿越初始平臺頻次明顯增加（P＜0.05），見表1。

表1 各組干預(yù)前后水迷宮試驗(yàn)指標(biāo)變化（n=40）Table 1 Changes in water maze experimental indicators before and after intervention in each group

2.3 各組干預(yù)前后模型組神經(jīng)功能評分變化

與試驗(yàn)前相比，試驗(yàn)后澤蘭素組、丁苯酞組神經(jīng)功能缺損程度評分明顯下降（P ＜0.05）；模型組評分比較則無明顯差異（P ＞0.05）。試驗(yàn)后Masao Shmiizu-Sasamata 神經(jīng)功能評分比較中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組評分下降，差異顯著（P ＜0.05），見表2。

表2 各組神經(jīng)功能評分干預(yù)前后的變化（n=40）Table 2 Changes of neurological function scores in each group before and after intervention

2.4 各組干預(yù)前后糖水偏好試驗(yàn)評價

與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組糖水偏好試驗(yàn)指數(shù)明顯上升，差異（P＜0.05）。與陽性藥物丁苯酞組相比，澤蘭素組糖水偏好試驗(yàn)指數(shù)略顯降低，但差異不顯著（P ＞0.05）。

2.5 ELISA檢驗(yàn)TNF- /NF- B、BNDF水平

表3 結(jié)果顯示，與空白組相比，澤蘭素組、丁苯酞組NF- B、BNDF 明顯上升，TNF- 明顯下降，差異極顯著（P ＜0.01）；與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組NF- B、BNDF明顯上升，TNF- 明顯下降，差異顯著（P＜0.05）。

表3 ELISA 檢驗(yàn)TNF- ，NF- B 和BNDF 的表達(dá)水平（n=40）Table 3 Detection of expression level of TNF- ,NF- B and BNDF by ELISA

3 討論

過量丙泊酚可過度激活海馬CA1 區(qū)谷氨酸受體導(dǎo)致調(diào)控功能障礙[7,8]，可導(dǎo)致空間認(rèn)知功能障礙及可逆性記憶減退。澤蘭水提取物能減輕神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激、自由基超載和抑制炎癥因子表達(dá)，減少神經(jīng)元缺血再灌注損傷等作用，其分子機(jī)制之一為促進(jìn)PI3K/Akt Pathway 及其下游HIF-1a 從而發(fā)揮拮抗ROS 等因子表達(dá)[9-11]，因此，澤蘭素理論上具備延緩丙泊酚海馬CA1 區(qū)受體損傷的作用，然而機(jī)制尚未探明。研究表明，NF- B 作為Rel 蛋白家族內(nèi)多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，是TLR4/MyD88信號通路調(diào)控節(jié)點(diǎn)，可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄IL-1 、IL-8 和TNF- 調(diào)控，激活炎癥因子表達(dá)，并抑制神經(jīng)元細(xì)胞炎癥凋亡[12-14]；TNF- 可降低海馬神經(jīng)元突觸間傳遞效率[15]，增強(qiáng)TNF- 受體疼痛遺忘效應(yīng)并降低突觸可塑性[16]；BDNF 可作為腦神經(jīng)元神經(jīng)保護(hù)的功能性指標(biāo)之一，具備維持神經(jīng)元突觸塑造、調(diào)控分化及神經(jīng)電生理損傷后再修復(fù)等功能，反應(yīng)海馬組織丙泊酚類化學(xué)藥物損傷再修復(fù)程度[17-20]。

海馬麻醉損傷往往導(dǎo)致快感喪失，經(jīng)典糖水偏好試驗(yàn)常用作衡量海馬受損抑郁狀態(tài)程度的重要指標(biāo)之一。本研究通過對海馬損傷模型小鼠進(jìn)行丙泊酚麻醉處理方式建立海馬麻醉損傷模型，使用陽性對照藥物丁苯酞、澤蘭素對模型鼠進(jìn)行試驗(yàn)。Morris水迷宮檢測結(jié)果顯示，澤蘭素組單位逃避時間、對側(cè)象限停留時間顯著縮短和穿越初始平臺頻次明顯增加，這表明澤蘭素提高了空間記憶鞏固能力及記憶提取的精確性。糖水偏好試驗(yàn)則證實(shí)，澤蘭素可有效增強(qiáng)對抗抑郁行為，緩解海馬損傷大鼠認(rèn)知功能的受損。

澤蘭素可使腦海馬組織內(nèi)TNF- 、BNDF 表達(dá)升高，NF- B 表達(dá)降低，此項(xiàng)結(jié)果表明，澤蘭素在增強(qiáng)突觸傳遞效率、腦神經(jīng)保護(hù)及TNF 受體調(diào)控突觸可塑性方面具備一定效應(yīng)，驗(yàn)證了澤蘭素對丙泊酚藥物麻醉損傷海馬功能的保護(hù)作用。

澤蘭素可顯著上調(diào)NF- B、BNDF 蛋白表達(dá)，抑制TNF- 合成和釋放，增強(qiáng)神經(jīng)元功能恢復(fù)，強(qiáng)化小鼠的空間規(guī)劃及瞬時記憶能力，協(xié)助抗抑郁，以緩解小鼠丙泊酚誘導(dǎo)的海馬組織損傷。