聶啟鴻 鐘曉鳴

LncRNA-GAS5 被確定為多種癌癥的抑癌基因,且被證實參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展。但是LncRNA GAS5在結直腸癌中的作用尚不明確。有研究顯示,LncRNA GAS5 通過干預磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)通路參與調(diào)控非小細胞肺癌細胞對順鉑(DDP)的化學敏感性［1］。以5-FU 為基礎的化學治療方案可有效治療結直腸癌,對改善無手術機會的患者的生存質(zhì)量、延長生存期尤為重要。但5-FU 耐藥大大限制其療效［2］。5-FU 耐藥機制的產(chǎn)生及應對策略是目前臨床工作中亟需解決的問題。因此,本研究將探討LncRNA GAS5 在5-FU 耐藥結直腸癌細胞中的表達變化及其對5-FU 耐藥結直腸癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人結腸癌細胞系HCT-8 和SW480 均購自American Type Culture Collection。

1.1.2 主要儀器與試劑 二氧化碳恒溫孵育箱(Thermo Fisher Scientific),伯樂化學發(fā)光凝膠成像儀(美國伯樂),RT-PCR 儀(ABI),Applied Biosystems 9700 PCR儀(Life Technologies),凝膠圖像分析儀(Alpha innotech),流式細胞儀(BD FACalibor)。通用型RNA提取試劑盒(廣州美基生物),Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco BRL),CCK-8 試劑盒、Lipofectamine 2000(Invitrogen),細胞RNA 提取試劑盒(北京天根生物),兔抗caspase-3 多克隆抗體、兔抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)多克隆抗體、兔抗B 淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)多克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體、兔抗Bcl-2 相關X 蛋白(Bax)多克隆抗體、過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Affinity),LV5-GAS5 Vector(上海吉瑪)。

1.2 細胞培養(yǎng)、傳代 將HCT-8 細胞系或SW480 細胞系用含10% FBS、100 IU/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的McCoy's 5A 培養(yǎng)基重懸細胞,接種于細胞培養(yǎng)瓶,37℃、5%二氧化碳孵育箱,當細胞生長至80%融合度時傳代。棄去培養(yǎng)基、清洗、消化、終止消化、離心,接種于培養(yǎng)皿中傳代,每2 天換1 次培養(yǎng)基,取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 5 -FU 耐藥細胞株建立 向細胞培養(yǎng)基中加入5-FU 溶液,與細胞共培養(yǎng)。觀察細胞狀態(tài)并逐步升高5-FU 濃度,篩選出對5-FU 耐藥的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR 檢測LncRNA GAS5 在結直腸癌 5-FU耐藥細胞系中表達 分別經(jīng)細胞總RNA 提取、RNA質(zhì)量鑒定、逆轉(zhuǎn)錄反應、RT-PCR 反應、PCR 產(chǎn)物的相對定量分析。

1.5 構建LncRNA GAS5 過表達結直腸癌細胞模型設計合成LncRNA GAS5 過表達序列,將合成的序列構建至慢病毒載體,包裝濃縮為 LncRNA GAS5 過表達慢病毒,將LV5-GAS5 慢病毒原液加入完全培養(yǎng)基；去除原細胞培養(yǎng)液,加入病毒培養(yǎng)液,孵育箱中培養(yǎng),細胞狀態(tài)恢復良好后,去除培養(yǎng)基,加入病毒培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育。同時用空載體Vector 建立對照組。

1.6 CCK-8 檢測細胞增殖 對HCT-8 和SW480 細胞分別用LV5-GAS5 慢病毒侵染(GAS5 組)與空載體慢病毒侵染(Vector 組),轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 后加入CCK-8 溶液,孵育4 h。酶標儀測定450 nm 處細胞吸光度。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 對HCT-8 和SW480細胞分別用LV5-GAS5 慢病毒侵染(GAS5 組)與空載體慢病毒侵染(Vector 組),48 h 后行Annexin V/PI 雙染,流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,組間比較用t檢驗；不同轉(zhuǎn)染濃度、不同時間點的細胞相對增殖率,采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA GAS5 在結直腸癌5-FU 耐藥細胞系中的表達 RT-PCR 檢測顯示,LncRNA GAS5 在結直腸癌 HCT-8 細 胞(見 圖1A) 與SW480 細 胞(見 圖1B)中的表達水平低于正常結腸細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 LncRNA GAS5 在結直腸癌5-FU 耐藥細胞系中表達情況

2.2 應用慢病毒載體構建LncRNA GAS5 過表達結直腸癌細胞模型 RT-PCR 檢測顯示,LV5-GAS5 組HCT-8 細 胞(見 圖2A)、SW480 細 胞(見 圖2B) 中LncRNA GAS5 表達顯著高于Vector 組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 LncRNA GAS5 在結直腸癌 5-FU 耐藥細胞系中表達情況

2.3 過表達 LncRNA GAS5 抑制結直腸癌細胞增殖CCK-8 實驗檢測顯示,LncRNA GAS5 能明顯抑制HCT-8 細胞和 SW480 細胞的增殖(P<0.05)。見圖3。

圖3 上調(diào)LncRNA GAS5 表達可降低結直腸癌耐藥細胞活性

2.4 流式細胞術檢測過表達LncRNA GAS5 促進結直腸癌細胞凋亡 AnnexinV/PI 雙重染色及流式細胞術結果顯示,在結直腸癌 HCT-8 細胞(見圖4A)與SW480細胞(見圖4B)中LV5-GAS5 組的細胞凋亡比例也明顯高于Vector 組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 上調(diào)LncRNA GAS5 表達促進結直腸癌耐藥細胞凋亡

3 討論

LncRNA GAS5 是LncRNA 家族成員之一,其在多種癌細胞中表達異常,如胃癌、非小細胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌等,被確定為多種癌癥的抑癌基因［3-6］。有研究分析結腸癌中RNA 差異表達的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),結腸腺癌中存在205 個LncRNAs 差異表達,LncRNA GAS5 也參與其中［7］。然而,LncRNA GAS5 在結直腸癌中的作用尚不明確。

結直腸癌是嚴重威脅人們生命的惡性腫瘤之一。隨著生活習慣和飲食結構的改變,我國結直腸癌發(fā)病率逐年升高［8,9］。多數(shù)結直腸癌在發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)局部進展或轉(zhuǎn)移,喪失手術機會［10］?；瘜W治療對其改善生存質(zhì)量、延長生存期尤為重要［10］。5-FU 可抑制胸苷酸合成酶活性干擾 DNA 制,誘導DNA 損傷,導致細胞周期阻滯和細胞凋亡［11］。以5-FU 為基礎的化療方案可有效治療結直腸癌,但目前臨床上5-FU 化療獲得性耐藥現(xiàn)象普遍發(fā)生,嚴重影響療效和預后［2］。深入研究5-FU 耐藥產(chǎn)生的機制及尋找有效的應對策略是臨床工作中亟需解決的問題。

研究發(fā)現(xiàn),LncRNA GAS5 參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞藥物抗性。LncRNA GAS5 可通過介導 ABCB1 調(diào)節(jié)乳腺癌阿霉素耐藥細胞對阿霉素的敏感性［12］。LncRNA GAS5 通過靶向抑制 miR-223-5p,抑制PI3K/Akt 信號通路,逆轉(zhuǎn)MCF-7 細胞對他莫昔芬的耐藥性［13］。但LncRNA GAS5 是否參與調(diào)控結直腸癌對5-FU 的耐藥尚不清楚。

為探討LncRNA GAS5 與結直腸癌5-FU 耐藥的關系,我們檢測了結直腸癌5-FU 耐藥細胞系HCT-8 細胞和SW480 細胞中LncRNA GAS5 的表達變化。結果發(fā)現(xiàn) LncRNA GAS5 在結直腸癌5-FU 耐藥細胞中顯著低表達。為了進一步探尋LncRNA GAS5 與5-FU 耐藥特性之間的關系,我們過表達HCT-8 細胞和SW480 細胞中LncRNA GAS5,檢測細胞對5-FU 的敏感性及生物學行為變化。結果發(fā)現(xiàn),過表達LncRNA GAS5 后,HCT-8 細胞和SW480 細胞的增殖受到抑制,且細胞凋亡明顯增加。這些研究結果表明LncRNA GAS5 在結直腸癌5-FU 耐藥中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述,LncRNA GAS5 在結直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮著關鍵的作用,能抑制結腸癌細胞系的增殖并促進其細胞凋亡。可為臨床上尋找以LncRNA GAS5 為靶點的結直腸癌治療方法提供理論依據(jù)。