李馮洋

肺癌為目前全球主要癌癥發(fā)病和死亡原因之一。據(jù)2018全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,全球癌癥發(fā)病率約為236.9/10萬,死亡率約為125.2/10萬,其中肺癌發(fā)病率和死亡率均位居首位[1]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為肺癌常見擴(kuò)散方式,亦是患者復(fù)發(fā)和死亡的主要原因之一。肺癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移是指在原發(fā)腫瘤外肺部出現(xiàn)的腫瘤,此時(shí)患者多處于晚期,預(yù)后較差[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞來源外泌體可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移靶器官形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境,并在循環(huán)腫瘤細(xì)胞定植后促進(jìn)生成腫瘤血管,進(jìn)而參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程[3]。除蛋白質(zhì)外,外泌體miRNA在包括肺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤進(jìn)展過程中亦起到關(guān)鍵性作用[4]。Kim等[5]研究發(fā)現(xiàn),腫瘤源性外泌體miR-619-5p可通過調(diào)節(jié)RCAN1.4,促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。目前國(guó)內(nèi)為尚缺乏對(duì)肺癌細(xì)胞源性外泌體miR-3473b對(duì)肺癌細(xì)胞肺內(nèi)轉(zhuǎn)移及B細(xì)胞數(shù)量的影響的研究。本研究對(duì)此進(jìn)行分析,旨在為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

小鼠肺癌細(xì)胞(LLC):購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司,貨號(hào)FS-0291。C57BL/6小鼠:80只,SPF級(jí),雌雄各半,購(gòu)自南京君科生物工程有限公司,貨號(hào)J006,周齡6～8周,體重110～120 g,自由飲食飲水,溫度(21±2)℃,濕度30%～70%,光照周期12/12小時(shí)。肺成纖維細(xì)胞:分離自C57BL/6小鼠肺組織。細(xì)胞均置于含10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(大連美侖生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)MA0212)中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

外泌體提取及miRNA檢測(cè):由上海宇玫博生物科技有限公司完成。碳支持膜(貨號(hào)AGS160H):英國(guó)Agar Scientific公司。3%磷鎢酸負(fù)染液(貨號(hào)G1871)、Cy5.5染料(貨號(hào)S1061)、膠原酶Ⅳ(貨號(hào)C8160)、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)SW2010)、總RNA提取試劑盒(貨號(hào)R1200)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RP1200):北京索萊寶科技有限公司。α-SMA(貨號(hào)HL80016):上海哈靈生物科技有限公司。DAPI染色液(貨號(hào)abs47047616):上海愛必信生物科技有限公司。BCA蛋白定量分析試劑盒(貨號(hào)23221):美國(guó)賽默飛世爾公司。膜封閉液(貨號(hào)SL1330):北京酷來搏科技有限公司。小鼠抗CD63單克隆抗體(貨號(hào)D198650):上海生工生物股份有限公司。小鼠抗Hsp90單克隆抗體(貨號(hào)AH732):上海碧云天生物技術(shù)有限公司。TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(貨號(hào)RR820A):新疆寶信生物技術(shù)有限公司。共聚焦顯微鏡(型號(hào)Auto 2):美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 LLC來源外泌體鑒定及行蹤 分離與鑒定:待LLC細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)80%時(shí),更換無外泌體血清DMEM高糖培養(yǎng)基;24 h后收集細(xì)胞上清液,室溫以2000 g離心30 min,取上清液移至新離心管,冰上保存;加入1/3體積外泌體提取試劑,4 ℃過夜;次日吸取2 mL液體于新離心管,4 ℃下以1500 g離心30 min,棄上清液;再次吸取2 mL液體于同一離心管,重復(fù)離心,直至所有液體均被吸取;取10 μL樣品于封口膜上,上方放置碳支持膜,吸附制樣;后將碳支持膜懸浮于3%磷鎢酸負(fù)染液復(fù)染3 min,干燥后,透射電鏡下觀察外泌體大小及形態(tài)。細(xì)胞攝取:將Cy5.5染料與LLC來源外泌體混合,經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi);24 h后收集肺組織,制作組織切片,以α-SMA染色;加入膠原酶Ⅳ,收集肺成纖維細(xì)胞;將肺成纖維細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中,2×105個(gè)/孔,加入Cy5.5標(biāo)記的LLC來源外泌體;3 h后棄去上清,以PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;室溫下以多聚甲醛固定10 min,PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;加入DAPI染色液,室溫孵育10 min;PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;加入1 mL的PBS緩沖液,共聚焦顯微鏡下觀察LLC來源外泌體行蹤。外泌體標(biāo)記蛋白表達(dá):采用蛋白免疫印跡法。取LLC細(xì)胞,加入RIPA裂解液裂解30 min,按照BCA蛋白定量分析試劑盒說明書操作,檢測(cè)相應(yīng)蛋白濃度;10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解產(chǎn)物后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,加入膜封閉液,室溫封閉1 h;分別滴加CD63和Hsp90抗體,4 ℃過夜;TBST沖洗3次,每次5 min;滴加HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h;TBST沖洗3次,每次5 min;按照ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒說明書操作,凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶分子量及光密度值。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)及外泌體內(nèi)miR-3473b表達(dá) 采用RT-PCR法。提取細(xì)胞RNA和外泌體miRNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;引物序列,miR-3473b上游引物:5＇-GCGGGCTGGAGAGATG-3＇,下游引物:5＇-GTGCAGGGTCCGAGGT-3＇;反應(yīng)體系:上游和下游引物各8 μL,TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL,cDNA 2 μL,4 ℃離心(1500 rpm)1 min,每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s(1個(gè)循環(huán)),95 ℃變性5 s(30個(gè)循環(huán)),60 ℃退火和延伸30 s(30個(gè)循環(huán));取8 μL PCR產(chǎn)物,加2 μL 5×Loading Buffer,混勻后置于2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色后,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.3.3 LLC來源外泌體對(duì)小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移及B細(xì)胞數(shù)量的影響 尾靜脈注射LLC來源外泌體,10 μg/20 g·次,1次/3 d;6 d后,尾靜脈注射LLC細(xì)胞,5×105個(gè),繼續(xù)注射LLC來源外泌體3次,以及miR-3473b抑制劑6次;22 d后處死小鼠,收集肺組織,采用HE染色法觀察小鼠肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及面積,流式細(xì)胞術(shù)分析肺部B細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4 LLC來源外泌體miR-3473b對(duì)肺成纖維細(xì)胞NF-κB通路的影響 應(yīng)用蛋白免疫印跡法。方法同1.3.1中外泌體標(biāo)記蛋白檢測(cè)步驟。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LLC來源外泌體鑒定及行蹤

透射電子顯微鏡顯示,LLC來源外泌體微囊泡直徑為30～100 nm,占80%以上(圖1A);LLC來源外泌體微囊泡中Hsp90、CD63呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1B);將Cy5.5標(biāo)記的LLC來源外泌體加入成纖維細(xì)胞4 h后,LLC來源外泌體(綠色熒光顆粒)可被細(xì)胞攝取(圖1C)。

A為L(zhǎng)LC來源外泌體大小和形態(tài)(箭頭所示);B為外泌體標(biāo)志物Hsp90、CD63表達(dá)(蛋白免疫印跡);C為成纖維細(xì)胞對(duì)Cy5.5標(biāo)記的外泌體攝取情況(免疫熒光)。

2.2 細(xì)胞內(nèi)及外泌體內(nèi)miR-3473b表達(dá)

LLC來源外泌體內(nèi)miR-3473b表達(dá)水平顯著高于細(xì)胞內(nèi)(t=5.498,P<0.01),見圖2。

圖2 細(xì)胞內(nèi)及外泌體內(nèi)miR-3473b表達(dá)

2.3 LLC來源外泌體miR-3473b對(duì)小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響

LLC來源外泌體組小鼠肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及面積顯著多于對(duì)照組(P<0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b組與LLC來源外泌體組小鼠肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及面積比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組小鼠肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及面積顯著低于LLC來源外泌體組(P<0.05),見圖3。

A為小鼠肺轉(zhuǎn)移數(shù)量比較;B為小鼠肺轉(zhuǎn)移面積比較。

2.4 LLC來源外泌體miR-3473b對(duì)小鼠肺內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量的影響

LLC來源外泌體組小鼠肺內(nèi)CD45+標(biāo)記免疫細(xì)胞中B細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組(P<0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b組與LLC來源外泌體組小鼠肺內(nèi)CD45+標(biāo)記免疫細(xì)胞中B細(xì)胞百分比比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組小鼠肺內(nèi)CD45+標(biāo)記免疫細(xì)胞中B細(xì)胞百分比顯著低于LLC來源外泌體組(P<0.05),見圖4。

圖4 LLC來源外泌體miR-3473b對(duì)小鼠肺內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量的影響

2.5 LLC來源外泌體miR-3473b對(duì)肺成纖維細(xì)胞NF-κB通路的影響

LLC來源外泌體組小鼠成纖維細(xì)胞p65和p-p65水平顯著高于對(duì)照組,Nfkbid水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b組與LLC來源外泌體組小鼠成纖維細(xì)胞p65、p-p65及Nfkbid水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LLC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組小鼠成纖維細(xì)胞p65和p-p65水平顯著低于LLC來源外泌體組,Nfkbid水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見圖5。

A為對(duì)照組;B為L(zhǎng)LC來源外泌體組;C為L(zhǎng)LC來源外泌體+miR-3473b組;D為L(zhǎng)LC來源外泌體+miR-3473b抑制劑組。

3 討論

外泌體為直徑為40～100 nm的盤狀囊泡,包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞均可分泌。腫瘤微環(huán)境中,外泌體為細(xì)胞間通訊及遺傳物質(zhì)傳遞的重要載體,參與了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。Huang等[6]研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌來源外泌體可通過傳遞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白,促進(jìn)正常肺成纖維細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。外泌體中包含RNA、miRNA、DNA等多種成分。近年研究表明,外泌體miRNA在肺癌新生血管生成、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[7]。miR-3473b在腫瘤進(jìn)展中作用尚未完全明確。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn),小鼠大腦中動(dòng)脈短暫性閉塞后,腦皮質(zhì)和紋狀體中miR-3473b表達(dá)顯著上調(diào),miR-3473b可通過增強(qiáng)卒中后神經(jīng)炎癥損傷,促進(jìn)卒中發(fā)病。表明miR-3473b可能與炎癥反應(yīng)發(fā)生有關(guān)。NF-κB信號(hào)通路為炎癥反應(yīng)啟動(dòng)的經(jīng)典通路之一。研究表明,NF-κB信號(hào)通路在介導(dǎo)肺癌炎癥反應(yīng)及細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移中有著重要意義[9]。Shen等[10]從胃癌AGS細(xì)胞中提取外泌體,并與間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞來源外泌體可通過激活NF-κB信號(hào)通路,增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞激活免疫細(xì)胞、維持炎癥環(huán)境、支持腫瘤生長(zhǎng)的能力。

本研究首先對(duì)LLC提取的外泌體形態(tài)學(xué)及標(biāo)志物鑒定發(fā)現(xiàn),肺癌源性外泌體微囊泡直徑為30～100 nm,占80%以上,且微囊泡中Hsp90、CD63呈陽(yáng)性表達(dá),與以往報(bào)道的肺癌源性外泌體相符[11]。既往研究表明,成纖維細(xì)胞為攝取肺內(nèi)外泌體主要細(xì)胞之一[12]。本研究將Cy5.5標(biāo)記的LLC來源外泌體加入α-SMA+成纖維細(xì)胞4 h后發(fā)現(xiàn),LLC來源外泌體可被細(xì)胞攝取,提示LLC來源外泌體可被肺成纖維細(xì)胞吸收。后經(jīng)RT-PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn),LLC來源外泌體內(nèi)miR-3473b表達(dá)水平顯著高于細(xì)胞內(nèi),提示外泌體miR-3473b參與調(diào)控肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為。劉艷芳等[13]研究發(fā)現(xiàn),腫瘤源性外泌體可通過激活肺上皮細(xì)胞Toll樣受體3表達(dá),促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成。朱萌等[14]研究發(fā)現(xiàn),低分化胃癌細(xì)胞來源外泌體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)miR-106a影響胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn),LLC來源外泌體可促進(jìn)肺癌細(xì)胞肺內(nèi)定植,注射miR-3473b抑制劑后,肺癌細(xì)胞肺內(nèi)定植顯著減少,提示miR-3473b抑制劑可減少肺癌細(xì)胞肺內(nèi)定植,可能與抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān),具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。B細(xì)胞為體液免疫主要細(xì)胞之一,可通過分泌抗體發(fā)揮免疫效應(yīng)。研究顯示,B細(xì)胞可誘導(dǎo)非保護(hù)性體液免疫,并可通過減弱體內(nèi)CD4+、CD8+T細(xì)胞反應(yīng),促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn),LLC來源外泌體可誘導(dǎo)肺內(nèi)B細(xì)胞聚集,可能與減弱T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān),注射miR-3473b抑制劑后,肺內(nèi)B細(xì)胞聚集情況顯著減輕,提示通過抑制LLC來源外泌體miR-3473b表達(dá),可顯著降低B細(xì)胞在肺內(nèi)聚集,有可能可增加癌癥免疫治療療效。另本研究還發(fā)現(xiàn),LLC來源外泌體可顯著抑制肺成纖維細(xì)胞Nfkbid表達(dá),并靶向激活NF-κB信號(hào)通路,提示NF-κB信號(hào)通路在LLC來源外泌體miR-3473b介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述,外泌體介導(dǎo)miR-3473b可能通過抑制肺成纖維細(xì)胞Nfkbid表達(dá),靶向激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)肺癌細(xì)胞肺內(nèi)轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)肺內(nèi)B細(xì)胞聚集。