石 巍 王亞蘋 田 赟

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤,在我國(guó)的發(fā)生率僅次于宮頸癌[1]。以往子宮內(nèi)膜癌治療多采用手術(shù)及放化療等[2]。近年來(lái),關(guān)于該疾病的分子機(jī)制和靶向治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究表明含血小板反應(yīng)蛋白的解聚素樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin,ADAMTS)家族共有19個(gè)成員[3],ADAMTS家族成員的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。ADAMTS家族的成員,如ADAMTS2、ADAMTS5、ADAMTS12和ADAMTS15均已證實(shí)可作為抑癌或者促癌因子[5-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)在胃腸道腫瘤中,ADAMTS19的表觀遺傳失活可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[9]。然而,ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)及作用機(jī)制尚未報(bào)道。本研究擬通過(guò)檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中ADAMTS19的表達(dá),并探討其臨床意義,為疾病靶向治療提供一個(gè)新的思路[10]。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選擇2017年1月至2019年12月于我院就診的子宮內(nèi)膜患者39例,分別取新鮮癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織(距離癌組織大于3 cm),所有標(biāo)本術(shù)后病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜樣腺癌及癌旁組織,診斷至少由兩名獨(dú)立的經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家完成。根據(jù)子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南(2021年版)標(biāo)準(zhǔn)確定子宮內(nèi)膜癌FIGO分期。入選患者中無(wú)應(yīng)用激素類藥物者、無(wú)合并其他惡性腫瘤者、無(wú)合并自身免疫性疾病者和未行放、化療者。所有組織離體后,迅速置于-80 ℃冰箱保存,并取石蠟切片子宮內(nèi)膜癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織各10例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象均自愿參加。

1.2 細(xì)胞

Ishikawa細(xì)胞購(gòu)自中科院協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

1.3 主要試劑

兔抗人ADAMTS19、p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,免疫組化試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物科技有限公司,lipofectamine3000、Trizol試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司,qRT-PCR試劑盒購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司,CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司,引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化(IHC)檢測(cè)ADAMTS19蛋白的表達(dá)將標(biāo)本固定、脫水、石蠟包埋,以4 μm為標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)切片,應(yīng)用二甲苯脫蠟,酒精脫水,3%H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,檸檬酸抗原修復(fù)。然后根據(jù)SP法對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行一抗(兔抗人ADAMTS19抗體)、二抗孵育,顯色,封片。光學(xué)顯微鏡下觀察染色。用Image J軟件評(píng)價(jià)染色強(qiáng)度,結(jié)果用陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值和陽(yáng)性面積百分比表示。

1.4.2 qRT-PCR檢測(cè)ADAMTS19 mRNA的表達(dá)量 qRT-PCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中ADAMTS19的mRNA水平表達(dá)情況。用消毒過(guò)的鋼珠在組織勻漿儀中研磨組織,按照Trizol的說(shuō)明書逐步提取總RNA,利用NanoDrop檢測(cè)樣品中的RNA濃度和純度,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)參數(shù)為:37 ℃ 15 min;50 ℃ 5 min;98 ℃ 5 min。SYBR熒光定量試劑盒中每孔20 μL,95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,65 ℃延伸15 s,共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)完成(表1)。用2-△△Ct法記錄各樣本表達(dá)量。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞(簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”),置于37 ℃的 5% CO2培養(yǎng)箱中,根據(jù)lipofectamine3000說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,共設(shè)計(jì)三條si-RNA,即si#1、si#2和si#3。24 h后提取總RNA,使用qRT-PCR檢測(cè)ADAMTS19的mRNA表達(dá),篩選干擾效率最好的一個(gè)的用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 在96孔板中接種Ishikawa細(xì)胞5×103個(gè)/孔,加入100 μL培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,分別用NC(對(duì)照組)和干擾效率最佳的ADAMTS19-siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h后,每孔加入CCK-8 10 μL,置于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中2 h,于450 nm處檢測(cè)光密度。

1.4.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 在6孔板中接種Ishikawa細(xì)胞4×105個(gè)/孔,加入培養(yǎng)液2 mL,待細(xì)胞完全貼壁后轉(zhuǎn)染24 h,將ADAMTS19沉默組和NC組分別用200 μL槍頭在6孔板底部劃一條線,再垂直它劃一條直線,PBS沖洗3次,添加新培養(yǎng)基,在劃痕0 h、24 h和48 h時(shí)拍照記錄。用Image J劃線法計(jì)算遷移距離。

1.4.6 transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 4 ℃完全融化Matrigel膠,按照1∶8稀釋混勻后在transwell上室每孔加入50 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜使其充分凝固成膜,加入200 μL培養(yǎng)基水化基質(zhì)膠,37 ℃ 15 min后棄去培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞,下室中加10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL孵育48 h。固定、染色,顯微鏡下每個(gè)小室取3個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)判讀。

1.4.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)ADAMTS19蛋白的表達(dá)水平 ADAMTS19 si-RNA組、NC組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄去廢液,PBS洗三遍后加入裂解液,充分混勻后置于冰上裂解30 min,12000 r/min離心10 min,收集蛋白上清。用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。上樣時(shí)每孔中加蛋白50 μg,80 V初始電泳,后改為120 V。4 ℃恒流100 mA下,蛋白轉(zhuǎn)膜90 min。5%脫脂奶粉中孵育2 h,加一抗(1∶1000,4 ℃過(guò)夜)、二抗(1∶20000,37 ℃ 90 min),ECL顯色試劑盒顯色,以β-actin為內(nèi)參,用Image J軟件分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.4.8 Western blot檢測(cè)p-STAT3蛋白的表達(dá)水平 ADAMTS19 si-RNA組、NC組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,按1.4.7中Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中ADAMTS19蛋白表達(dá)低于癌旁組織

ADAMTS19蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,顯微鏡下呈棕黃色、顆粒狀分布。對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中ADAMTS19蛋白表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果提示,子宮內(nèi)膜癌組織中ADAMTS19的平均表達(dá)水平為(1.05±0.68),對(duì)應(yīng)癌旁組織為(3.52±1.56),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=4.227,P<0.001)。

2.2 ADAMTS19 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)39對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中ADAMTS19的表達(dá)情況,結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中的ADAMTS19 mRNA表達(dá)分別為(0.02±0.03)和(0.11±0.16),ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1,T=3.833,P<0.001)。

圖1 ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2.3 ADAMTS19表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

以子宮內(nèi)膜癌組織中ADAMTS19 mRNA表達(dá)中位值作為截?cái)帱c(diǎn),將患者分為高表達(dá)組(n=19例)和低表達(dá)組(n=20例)。對(duì)ADAMTS19表達(dá)與其臨床參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明,ADAMTS19的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織分化程度密切相關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、BMI、是否絕經(jīng)無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織中ADAMTS19表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

2.4 檢測(cè)ADAMTS19 si-RNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞的最佳效率

實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染ADAMTS19 si#1、si#2、si#3的三組細(xì)胞,陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染NC的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后NC組、si#1組、si#2組和si#3組中ADAMTS19相對(duì)表達(dá)量分別為(4.18±0.13)、(1.00±0.82)、(2.43±0.29)、(3.80±0.12)(表3),與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染si#1的細(xì)胞中ADAMTS19的表達(dá)水平降低最為明顯,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,T=35.630,P<0.001)。因此選擇si#1用于細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞ADAMTS19表達(dá)情況

表3 不同組細(xì)胞中ADAMTS19的相對(duì)表達(dá)量

2.5 沉默ADAMTS19能顯著促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的增殖能力

用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定si#1組和NC組細(xì)胞的吸光度,結(jié)果提示:轉(zhuǎn)染si#1的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3,P<0.001),提示沉默ADAMTS19可促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的增殖能力。

圖3 ADAMTS19對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖能力影響

2.6 沉默ADAMTS19能顯著增強(qiáng)Ishikawa細(xì)胞的遷移能力

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后,si#1組劃痕寬度明顯比對(duì)照組寬度窄,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4,T=7.706,P=0.002),表明沉默ADAMTS19可以促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的遷移能力。

圖4 ADAMTS19對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移能力的影響

2.7 沉默ADAMTS19能顯著增強(qiáng)Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力

與NC組比較,轉(zhuǎn)染si#1的實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖5);NC組與轉(zhuǎn)染si#1的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(94.33±4.73),(908.33±33.61),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=41.550,P<0.001)。提示沉默ADAMTS19可以促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 沉默ADAMTS19后Ishikawa細(xì)胞侵襲情況(400×)

2.8 沉默ADAMTS19后p-STAT3蛋白表達(dá)明顯增高

si#1組細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)水平較NC組明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

圖6 沉默ADAMTS19后細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)情況

3 討論

研究表明[11],ADAMTS的家族成員由19個(gè)分泌型多結(jié)構(gòu)域鋅指金屬蛋白酶組成,能參與機(jī)體多種過(guò)程,如凝血、關(guān)節(jié)炎和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。已有文獻(xiàn)報(bào)道[12-13],ADAMTS家族成員可以參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ADAMTS家族的成員可作為癌癥抑制因子或啟動(dòng)子,該家族已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)方向。研究證實(shí):在結(jié)直腸癌中,ADAMTS的表達(dá)下調(diào),且與不良預(yù)后相關(guān)[14];ADAMTS18的低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后密切相關(guān),且在體外具有抗腫瘤增生能力[15];ADAMTS5在口腔鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá),且與腫瘤病例分化程度有關(guān),是潛在的口腔鱗癌治療靶點(diǎn)[16]。然而,迄今為止,子宮內(nèi)膜癌中ADAMTS19的表達(dá)情況及機(jī)制仍是未知的。

已有不少研究證實(shí),多個(gè)表觀遺傳學(xué)相關(guān)分子與子宮內(nèi)膜癌有關(guān),相應(yīng)的靶向藥物也為治療提供新的方法和手段,同時(shí)研究新的生物學(xué)標(biāo)志物和探索靶點(diǎn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療有一定的指導(dǎo)意義。本文擬研究ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、生物學(xué)作用及其意義。通過(guò)qRT-PCR和免疫組化方法對(duì)臨床樣本分析結(jié)果證實(shí):在子宮內(nèi)膜癌組織中的ADAMTS19表達(dá)較癌旁組織中明顯降低,提示低表達(dá)的ADAMTS19可能與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān);且通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)ADAMTS19的低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織的分化程度密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明:沉默ADAMTS19后Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng),表明ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌的形成與演變過(guò)程中起重要作用,參與了子宮內(nèi)膜的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程;提示ADAMTS19有望成為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌及監(jiān)測(cè)腫瘤疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物,并為靶向治療提供新思路。

細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)蛋白家族包括七個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,其中STAT3被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[17]。STAT3有兩種存在形式,一種是以二聚體的形式存在,穩(wěn)定且難以降解,另一種是磷酸化的STAT3(p-STAT3)[18]。在細(xì)胞質(zhì)中,STAT3可以被Janus磷酸化為p-STAT3。p-STAT3進(jìn)入細(xì)胞核后可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,耐藥,或抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。已經(jīng)有研究證實(shí),p-STAT3過(guò)表達(dá)與胃癌[20]、直腸癌[21]等患者的不良預(yù)后有關(guān)。本研究中,沉默ADAMTS19后p-STAT3蛋白表達(dá)明顯上調(diào),推測(cè)ADAMTS19可能是通過(guò)激活p-STAT3信號(hào)通路,引起p-STAT3蛋白表達(dá)增多,引起子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。

綜上所述,本研究首次探討ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其意義,證實(shí)ADAMTS19在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá),沉默ADAMTS19可以促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移;且ADAMTS19的低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織的分化程度密切相關(guān);提示ADAMTS19的表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較少,后續(xù)研究需加大樣本量,并進(jìn)一步從基因?qū)用嫔钊胙芯緼DAMTS19在子宮內(nèi)膜癌中的發(fā)病機(jī)制。