鄭洋濱，劉寧，周年，熊明朋，洪燕

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

夏枯草為唇形科夏枯草屬植物，味辛、苦，寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清火瀉火、明目、散結(jié)消腫之功效；主要具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓等藥理作用［1］。夏枯草口服液和夏枯草膏已廣泛應(yīng)用于臨床，主要有清火，散結(jié)，消腫的作用。已有文獻報道夏枯草提取物在體外有一定的抗炎作用［2-5］，但由于中藥提取物成分復(fù)雜，在體內(nèi)經(jīng)過一系列代謝后難以保證達到和體外一樣的藥效。將中藥提取物對動物進行灌胃后，取動物的含藥血清用于體外實驗，就比較接近于藥物在人體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的藥理作用［6］。因此，本研究通過細菌脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬細胞RAW 264.7 造成炎癥模型，觀察夏枯草提取物含藥血清對炎性因子一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠40只，180～220g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：NO.430726211100071368，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014。飼養(yǎng)于江西省藥品檢驗檢測研究院屏障級環(huán)境中，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2019-0001。

1.2 細胞株

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW 264.7）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 實驗樣品及試劑

夏枯草藥材購自黃慶仁棧華氏大藥房，經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室萬林春主任中藥師鑒定為正品。RAW 264.7 專用完全培養(yǎng)基、無血清的DMEM 培養(yǎng)基、脂多糖（LPS）（批號分別為WH1622C291、WH0021D161、No.0109A031，均購自上海語純生物科技有限公司）。一氧化氮含量檢測試劑盒［批號：No.20220406，金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司，批號：No.20220406］。小鼠IL-1β ELISA 試劑盒、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（批號均為04/2022，均購自上海語純生物科技有限公司）。

1.4 實驗儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，型號：311）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號MULTISKAN GO）；細胞計數(shù)器（上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備

SD 大鼠40 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，隨機分為空白對照組和夏枯草氯仿提取物組，夏枯草乙酸乙酯提取物組，夏枯草正丁醇提取物組，每組10 只。灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液（按照得率計算12.5 mg/kg），10 mL/kg，每天2 次，連續(xù)3 d，空白對照組給予等體積的純化水。末次給藥后1 h，麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，4 ℃靜置30 min 后，3 000 r/min 離心15 min 分離含藥血清。將同組大鼠血清混勻，56 ℃水浴加熱30 min 滅活血清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 含藥血清對細胞增殖度的影響試驗

取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 細胞，取用無菌細胞刮刮下細胞，再用槍吹打成單細胞懸液。將細胞懸液離心（1 000 r/min，5 min），棄去上清，用無血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)細胞數(shù)為1×105個/mL，100 μL/孔接種于96孔板。待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，按空白對照（10%胎牛血清），陰性對照（20%空白對照組大鼠血清），5%、10%、20%各提取物組含藥血清孵育，每組設(shè)6 個復(fù)孔，每孔加100 μL。孵育24 h 后，吸棄上清，每孔加100 μL 不含血清的DMEM 培養(yǎng)基和20 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL 的DMSO，490 nm 處測定吸光度。細胞增殖率=各給藥組吸光度/空白對照組吸光度×100%。

2.3 含藥血清對巨噬細胞RAW264.7 的炎性因子的影響試驗

取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 細胞，用細胞刮刮下細胞，吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液離心（1 000 r/min，5 min），棄去上清，用無血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)細胞數(shù)為1×105個/mL，接種于24 孔板中，每孔1.5 mL，24 h 細胞貼壁后，加入相應(yīng)血清。

LPS 用無血清 DMEM 培養(yǎng)基溶解，稀釋至濃度100 μg/mL 作為母液。將貼壁后細胞分為陰性對照組，模型對照組，各提取物高、中、低劑量組（分別為20%含藥血清、10%含藥血清、5%含藥血清）。陰性對照組加入空白對照組大鼠血清400 μL 和無血清DMEM 培養(yǎng)基100 μL；模型對照組加入空白對照組大鼠血清400 μL、無血清DMEM 培養(yǎng)基80 μL 和LPS 母液20 μL；20%含藥血清組加入含藥血清400 μL、無血清DMEM 培養(yǎng)基80 μL 和LPS 母液20 μL；10%含藥血清組加入含藥血清200 μL、空白對照組大鼠血清200 μL、無血清DMEM 培養(yǎng)基80 μL 和LPS 母液20 μL；5%含藥血清組加入含藥血清100 μL、空白對照組大鼠血清300 μL、無血清DMEM 培養(yǎng)基80 μL 和LPS 母液20 μL。

每一劑量組設(shè)3 個復(fù)孔，LPS 終濃度為1 μg/mL。繼續(xù)孵育24 h 后，收集上清液，采用ELISA 法按照試劑盒說明書測定的含量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 含藥血清對細胞增殖度的影響

試驗結(jié)果表明，夏枯草各提取物含藥血清對RAW 264.7 的增殖無影響。見圖1。

圖1 含夏枯草各提取物血清對細胞增殖度的影響

4.2 含藥血清對巨噬細胞RAW264.7 的炎性因子的影響

試驗結(jié)果表明，模型對照組各炎性因子含量均顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。高、中、低劑量的夏枯草氯仿提取物含藥血清均能降低IL-6和NO 含量，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；此外，高、中劑量的夏枯草氯仿提取物含藥血清還能降低IL-1β 和TNF-α 含量，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 含藥血清對巨噬細胞RAW264.7的炎性因子的影響（，n=3）

注：與陰性對照組比較，aP<0.01；與模型對照組比較，bP<0.01，cP<0.05。IL-1β：白細胞介素1β；IL-6：白細胞介素6；NO：一氧化氮；TNF-α：腫瘤壞死因子。

5 結(jié)論

內(nèi)毒素誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞模型，被廣泛用于體外的抗炎實驗中。RAW264.7 細胞在LPS 刺激下，可使細胞炎癥介質(zhì)和促炎細胞因子的分泌增加，如：TNF-α、IL-6 和IL-1β、NO。IL-1β 是最重要的炎性細胞因子之一，它介導(dǎo)了炎癥的重要過程，大量產(chǎn)生時引起發(fā)熱和惡病質(zhì)［6］。TNF-α 是炎癥反應(yīng)的始動因子，可使黏附的中性粒細胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，并促進其他多種促炎細胞因子的表達［7-9］。IL-6 多功能炎性細胞因子，具有致炎和抗炎的雙向功能，當(dāng)產(chǎn)生過多會引起一系列的炎性損害，體內(nèi)IL-6 水平上升，可以導(dǎo)致多種疾病［10-11］。NO 在炎癥反應(yīng)中的作用機制復(fù)雜，不同酶產(chǎn)生的NO 作用不一，在病理狀態(tài)中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）廣泛表達，NO 水平升高造成局部組織損傷［12-13］。

本次試驗中，經(jīng)20%、10%和5%氯仿提取物含藥血清孵育后，可顯著降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞分泌的IL-6 和NO 水平（P<0.05）。經(jīng)20%和10%氯仿提取物含藥血清孵育后，可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞分泌的IL-1β 和TNF-α 水平（P<0.05）。正丁醇和乙酸乙酯提取物含藥血清對炎性因子均無顯著影響，說明無抗炎作用。

綜上所述，夏枯草氯仿提取物含藥血清能顯著降低炎癥模型中的炎性因子含量。但是其具體的作用機制，還有待進一步試驗。