賈力，王蕾，支榮榮

鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鹽城 224055

減肥膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)WS-11266（ZD-1266）-2002，由番瀉葉、虎杖、海藻酸鈉、人參莖葉皂苷粉組成。該制劑具有清熱、活血、降濁的功效，用于痰瘀互結(jié)之高脂血癥［1］。處方中番瀉葉具有瀉熱行滯，通便，利水的功效。番瀉葉中含有二蒽酮類(lèi)衍生物，具有瀉下的作用，其中瀉下作用最為顯著的是番瀉苷A 和番瀉苷B［2-3］?；⒄染哂欣麧裢它S，清熱解毒，散瘀止血的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，虎杖及其活性成分虎杖苷具有降血脂、改善微循環(huán)、抗氧化等作用［4-5］。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)由于批準(zhǔn)日期較早，限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)研究條件，檢驗(yàn)項(xiàng)目?jī)H有理化鑒別、HPLC 測(cè)定大黃素含量。而大黃素具有抗炎的作用，并沒(méi)有瀉下清熱及降血脂的功效，顯然作為質(zhì)控指標(biāo)是不合理的。因此，本研究以番瀉葉中番瀉苷A 和番瀉苷B，虎杖中虎杖苷三個(gè)有效成分為對(duì)象，建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定三種成分的含量，以期更為簡(jiǎn)便、全面地控制該制劑質(zhì)量。另外，番瀉葉、虎杖在處方中均以中藥原粉入藥，未經(jīng)提取工藝，本研究建立了該兩種中藥粉末的顯微鑒別方法。

處方中海藻酸鈉是藻類(lèi)植物的提取物，但其含量測(cè)定方法目前尚無(wú)報(bào)道；人參莖葉皂苷具有活血化瘀功效，對(duì)高血脂具有輔助治療的功效，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中已建立TLC 鑒別方法，故本研究未對(duì)海藻酸鈉及人參莖葉皂苷含量測(cè)定作進(jìn)一步研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LEICA DM 3000 顯微鏡（德國(guó)萊卡顯微系統(tǒng)有限公司）；Ultimate U3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；BP211D 電子天平（梅特勒托利多科技有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克科技有限公司）。

1.2 試劑試藥

番瀉苷A 對(duì)照品（批號(hào)：110824-202003，含量：97.2%），番瀉苷B 對(duì)照品（批號(hào)：110825-202004，含量：96.0%），虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)：111575-201603，含量：87.3%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；醋酸、磷酸氫二鈉、醋酸鈉、碳酸氫鈉、四庚基溴化銨、乙腈、乙醇等均為色譜純，水合氯醛、丙三醇為分析純；減肥膠囊（吉林省銀諾克藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026991，批號(hào)：20210801、20210703、20200506，規(guī)格：0.3 g/粒）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別［6-7］

番瀉葉粉末顯微特征：晶纖維多。非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)100～350 μm，直徑12～25 μm，壁厚，有疣狀突起。草酸鈣簇晶存在于葉肉薄壁細(xì)胞中，直徑9～20 μm。上下表皮細(xì)胞表面觀(guān)呈多角形，垂周壁平直；上下表皮均有氣孔，主為平軸式，副衛(wèi)細(xì)胞大多為2～3 個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 番瀉葉粉末顯微圖（×400倍）

虎杖粉末顯微特征：草酸鈣簇晶極多，較大，直徑30～100 μm。石細(xì)胞淡黃色，類(lèi)方形或類(lèi)圓形，有的呈分枝狀，分枝狀石細(xì)胞常2～3 個(gè)相連，直徑24～74 μm，有紋孔，胞腔內(nèi)充滿(mǎn)淀粉粒。木栓細(xì)胞多角形或不規(guī)則形，胞腔充滿(mǎn)紅棕色物。具緣紋孔導(dǎo)管直徑56～150 μm。見(jiàn)圖2。

圖2 虎杖粉末顯微圖（×400倍）

2.2 番瀉葉、虎杖主成分的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件［8］色譜柱：SVEA opal C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-［醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.0）（1 →10）混合溶液1 000 mL 中，加入四庚基溴化銨2.45 g］（23∶77）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm（番瀉苷A、番瀉苷B），306 nm（虎杖苷）；柱溫：30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備分別取番瀉苷A 對(duì)照品10.52 mg、番瀉苷B 對(duì)照品15.79 mg、虎杖苷對(duì)照品11.58 mg，分別置25 mL、50 mL、100 mL 棕色量瓶中，分別加0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液制成每1 mL 含番瀉苷A 0.409 0 mg、番瀉苷B 0.303 2 mg、虎杖苷0.101 1 mg 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（供加樣回收率試驗(yàn)用）。分別精密吸取三種儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液至刻度，制成每1 mL 含番瀉苷A 40.90 μg、番瀉苷B 30.32 μg、虎杖苷10.11 μg 的對(duì)照品混合溶液（供含量測(cè)定及線(xiàn)性關(guān)系考察用）。

2.2.3供試品溶液的制備取樣品細(xì)粉約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理15 min（30～40 ℃），放冷，再稱(chēng)定重量，用0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對(duì)照溶液按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備工藝制備取缺番瀉葉及缺虎杖的陰性樣品，各取0.5 g，同供試品溶液的制備方法制備。

2.2.5專(zhuān)屬性試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果供試品色譜在與混合對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有相同色譜峰，番瀉葉陰性樣品在番瀉苷A 和番瀉苷B 的位置上無(wú)色譜峰，虎杖陰性樣品在虎杖苷的位置上無(wú)色譜峰。表明供試品中其他成分對(duì)目標(biāo)成分無(wú)干擾，本方法有良好的專(zhuān)屬性。見(jiàn)圖3。

圖3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖:A.番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺番瀉葉陰性對(duì)照溶液；D.缺虎杖陰性對(duì)照溶液

2.2.6線(xiàn)性關(guān)系考察精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、4、10、16、20、30 μL 進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得回歸方程，結(jié)果表明，各成分在各自范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系表

2.2.7精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷峰面積的RSD 分別為0.20%、0.52%、0.78%（n=6），精密度良好。

2.2.8穩(wěn)定性考察吸取同一份供試品溶液，于0，6，12，24，48 h 分別進(jìn)樣10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷峰面積的RSD 分別為0.30%、0.63%、0.55%（n=5），供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)為20210801），按“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6 份，依次測(cè)定，番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷的平均含量分別為1.486 2 mg/g、1.066 5 mg/g、0.433 3 mg/g，RSD 分別為0.41%、0.55%、0.98%，重復(fù)性良好。

2.2.10加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的樣品0.25 g，六份，分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的番瀉苷A、番瀉苷B、虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各0.9 mL（0.368 1 mg）、0.9 mL（0.272 9 mg）、1.0 mL（0.101 1 mg），依法制得供試品溶液（對(duì)照品體積代入公式計(jì)算含量）。分別吸取上述溶液各10 μL 測(cè)定回收率。見(jiàn)表2～4。

表2 番瀉苷A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 番瀉苷B加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4 虎杖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.11樣品含量測(cè)定照“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定3批樣品，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 討論

3.1 顯微特征的選擇

處方中，海藻酸鈉和人參莖葉皂苷粉均為提取物，不具備生藥組織細(xì)胞特征，番瀉葉和虎杖均為原粉入藥，番瀉葉具有晶纖維、非腺毛、草酸鈣簇晶、表皮細(xì)胞（氣孔）等特征，虎杖具有草酸鈣簇晶、石細(xì)胞、木栓細(xì)胞、具緣紋孔導(dǎo)管等特征。兩味藥組織特征差異較大，具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬性，雖然兩者均有草酸鈣簇晶，但是番瀉葉簇晶細(xì)小，而虎杖簇晶粗大，很易區(qū)分，因此，直觀(guān)、簡(jiǎn)便、環(huán)保的顯微鑒別可以代替薄層色譜等其他鑒別方法。

3.2 色譜條件的選擇

選擇比較了《中國(guó)藥典》2020 年版一部番瀉葉和虎杖含量測(cè)定項(xiàng)中的流動(dòng)相［8］，番瀉苷A、番瀉苷B 在虎杖含量測(cè)定流動(dòng)相系統(tǒng)中，不能出峰，而虎杖苷在番瀉葉含量測(cè)定所用流動(dòng)相中能有效分離，且準(zhǔn)確度、精密度均符合藥典要求，故選擇番瀉葉含量測(cè)定的流動(dòng)相系統(tǒng)。同時(shí)比較了乙腈-0.1%三氟乙酸、乙腈-0.1%磷酸流動(dòng)相，供試品分離度均較差［9-10］。

3.3 供試品提取方法的選擇

番瀉苷在0.1%碳酸氫鈉溶液中溶解性較好，虎杖苷在稀乙醇中溶解度較好［8］，兼顧兩種成分的溶解性，本研究采用0.1%碳酸氫鈉稀乙醇溶液同時(shí)提取兩種成分，經(jīng)與《中國(guó)藥典》規(guī)定的兩種藥材提取溶劑比較，提取效率相當(dāng)。本研究還考察了溶劑體積、回流、超聲、提取時(shí)間等因素，最終確定了“2.2.3”項(xiàng)下供試品制備方法?？紤]到虎杖苷對(duì)光的不穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)需要避光。