尹祥佳 翟 琛 李 晶 南 銘 郝 楠

（1 蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州 730070）

黨的二十大報告指出，要加快建設(shè)農(nóng)業(yè)強國，扎實推動鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)、人才、文化、生態(tài)、組織振興；2023 年中央一號文件明確提出，全面推進鄉(xiāng)村振興，加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化[1-2]。因此，要立足國情農(nóng)情，要將實現(xiàn)具有中國特色的農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化作為全面建設(shè)社會主義現(xiàn)代化國家的重要組成和戰(zhàn)略支撐。農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的基礎(chǔ)是種子，種業(yè)又是農(nóng)業(yè)的“芯片”，是國家戰(zhàn)略性、基礎(chǔ)性核心產(chǎn)業(yè)，是推動我國農(nóng)業(yè)跨越式發(fā)展的重要引擎[3]。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2022 年全國糧食播種面積11833.21 萬hm2，全國糧食總產(chǎn)量68652.8 萬t，其中玉米播種面積為4307.01 萬hm2，玉米產(chǎn)量是27720.3 萬t，分別占36.4%和40.4%，穩(wěn)居我國糧食作物第1 位。

近年來，我國糧食總產(chǎn)量的連續(xù)增長得益于種業(yè)的發(fā)展和種子的貢獻度，種業(yè)的發(fā)展離不開種業(yè)科技創(chuàng)新的支撐[4]。隨著玉米全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，全方位研究玉米基因功能及其應(yīng)用是當(dāng)前玉米分子育種研究的重要內(nèi)容。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)具有易操作、效率高和擴展性強等顯著優(yōu)點，已成為開展玉米基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究最有力的遺傳操作方式[5]。我國科學(xué)家在CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的研發(fā)、精準開展玉米分子育種、獲得改良的玉米育種材料等方面取得了一定的突破[6]。通過闡述CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的研究歷程、類型和作用原理，概述CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在玉米分子育種中的應(yīng)用，實現(xiàn)玉米育種材料的分子改良，不斷加強基因編輯作物監(jiān)管，能夠為玉米分子育種研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)

1.1 CRISPR/Cas9 基因編輯研究歷程植物基因編輯技術(shù)是指以植物的特定功能基因為研究對象，采用基因編輯技術(shù)對這些特定基因的編碼序列進行特異編輯，對基因組中的靶位點進行敲除、替換、插入等定點人工修飾，進行分子改良，最終實現(xiàn)植物的優(yōu)良性狀能夠穩(wěn)定遺傳，經(jīng)過基因組改造后的植物稱為基因編輯植物?；蚓庉嫾夹g(shù)有鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）[7]。TALENs 和CRISPR/Cas9 相繼入選2012年、2013 年《科學(xué)》十大科學(xué)突破。相關(guān)研究文獻對3 種基因編輯技術(shù)作了比較（表1）[8]。Ishino 等[9]于1987 年首先發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌堿性磷酸酶基因附近存在串聯(lián)間隔重復(fù)序列。2002年完成了嗜熱鏈球菌全基因組序列測序后，Horvath等[10]首次提出了CRISPR 的概念。Barrangou 等[11]于2007 年證明了細菌用CRISPR 抵御外來噬菌體的入侵，并在自身基因組中留下外來基因片段作為“記憶模式”，其實是廣泛存在于細菌和古細菌中的免疫防御系統(tǒng)。研究表明[12-13]，天然的CRISPR/Cas9 分為Cas9、crRNA 和tracrRNA 3 個部分，crRNA和tracrRNA 通過局部堿基配對組成gRNA，而gRNA 與Cas9 結(jié)合后引導(dǎo)Cas9 蛋白識別和切割目標DNA 序列，后來科學(xué)家對這一編輯技術(shù)進行了改造，將crRNA 和tracrRNA 融合成1 條RNA，并稱其為sgRNA。改造后的CRISPR/Cas9 成為研究者首選的基因編輯研究方法，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成為近些年玉米分子育種研究的熱點領(lǐng)域。

表1 基因編輯技術(shù)比較

1.2 CRISPR/Cas9 基因編輯類型目前大約有40%細菌和90%古細菌已經(jīng)被測序，CRISPR/Cas類型有3 種，其中的TypeⅡ型CRISPR/Cas 較為簡單，以Cas9 蛋白以及導(dǎo)向RNA 為核心組成，是在細胞或生物體內(nèi)引入Cas9 酶和設(shè)計不同的導(dǎo)向RNA（sgRNA），來指導(dǎo)Cas9 完成對DNA 的定點切割修飾[14-15]。Type Ⅰ型是相對較為復(fù)雜的編輯系統(tǒng)，包含6 個Cas 蛋白質(zhì)（Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas6、Cas7），主要來源于大腸桿菌等細菌、銅綠假單胞菌等古生菌，其中特征性的Cas3 蛋白具有解旋酶和核酸酶功能，是干擾階段的主要作用酶類。TypeII 型包含4 個Cas 蛋白質(zhì)（Cas1、Cas2、Cas4、Cas9），主要來源于激烈火球菌等古生菌，Cas9 是分子質(zhì)量很大的多功能蛋白，能夠參與crRNA 的成熟以及降解入侵的噬菌體核酸或是外源質(zhì)粒，同時還在剪切crRNA 的成熟和靶標DNA 中起到了重要作用，是目前基因組定向編輯技術(shù)的主要應(yīng)用類型。TypeIII 型包含4 個Cas 蛋白質(zhì)（Cas1、Cas2、Cas6、Cas10），其中特征性的Cas10 蛋白質(zhì)主要參與crRNA 的成熟和剪切入侵外源DNA，目前發(fā)現(xiàn)存在2 種亞型TypeⅢA 和TypeⅢB。自然界中的CRISPR/Cas 編輯系統(tǒng)具有一定的多態(tài)性，因此，立足現(xiàn)有的編輯系統(tǒng)進一步開發(fā)新型和高效的基因編輯技術(shù)也是關(guān)鍵的研究方向。

1.3 CRISPR/Cas9 基因編輯作用原理CRISPR/Cas9 基因編輯的作用原理分為3 個階段。首先是來源于病毒的小段DNA 整合到細菌的CRISPR 中生成新的間隔和重復(fù)序列單元，外源DNA 的間隔序列前體側(cè)翼有一段保守短序列稱為PAM，它是獲取DNA片段所需的識別序列。其次是CRISPR 在前導(dǎo)序列的驅(qū)動下轉(zhuǎn)錄出前體pre-crRNA，被特定核酸內(nèi)切酶加工成crRNA，隨后與反式激活tracrRNA 結(jié)合形成sgRNA 復(fù)合體，引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶移動至病毒DNA 的部位，指引特定的Cas9 酶降解外源核酸[16]。

所以，應(yīng)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定向改良作物靶基因的流程一般分為6 個步驟：一是靶位點設(shè)計；二是構(gòu)建CRISPR/Cas9 sgRNA 表達載體；三是驗證sgRNA 靶向力；四是作物遺傳轉(zhuǎn)化和篩選抗性愈傷；五是分子檢測和測序鑒定突變類型；六是再生植株鑒定和后代純合體的篩選。由于CRISPR/Cas9 編輯技術(shù)的載體構(gòu)建較為簡單，具有成本低等優(yōu)勢，在玉米功能基因驗證、產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性改良分子育種研究中發(fā)揮了重要作用。

2 玉米分子育種中的應(yīng)用概述

2.1 功能基因驗證功能基因驗證、挖掘有效基因為后續(xù)開展基因編輯技術(shù)或者轉(zhuǎn)基因等分子育種提供了前提基礎(chǔ)。楊敏等[17]以玉米B104 中克隆的ZmFKF1為靶基因，用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)進行定點編輯，并對純合突變體進行了表型分析和基因表達驗證，明確了ZmFKF1在玉米開花過程中具有正調(diào)控的作用，為玉米分子育種及遺傳改良提供了理論依據(jù)。雷海英等[18]以玉米自交系材料B104 為研究受體材料，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)鑒定了玉米發(fā)育相關(guān)基因ZmCen，推測其與玉米植株雄花序發(fā)育有關(guān)。邢瑞霞[19]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功獲得了參與玉米光周期調(diào)控途徑的敏感基因ZmCCT10和ZmCCT9的相關(guān)突變體，驗證了改良玉米開花期，能夠適當(dāng)縮短生育周期。因此，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)驗證克隆基因的功能，進一步明晰功能基因與性狀的關(guān)聯(lián)研究具有重要的應(yīng)用價值。

2.2 產(chǎn)量育種玉米產(chǎn)量提升一直是育種家的研究目標。玉米的種植產(chǎn)量不僅與品種的穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、粒長和粒重等數(shù)量性狀相關(guān)，還與玉米種植密度和種植栽培條件有關(guān)。玉米雌花花序發(fā)育一般開始于9～10 葉期，葉腋分生組織（AM）將轉(zhuǎn)換成花序分生組織（IM），隨后IM 上形成多行排列整齊的小穗分生組織（SPM），因此，通過提升玉米花序分生組織活性，可以有效增加玉米果穗穗行數(shù)和粒重。Liu 等[20]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)突變ZmCLE7和ZmFCP1等位基因資源，精細調(diào)控候選基因表達水平，強化了玉米產(chǎn)量性狀，提高了玉米籽粒產(chǎn)量。徐倩等[21]用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對玉米籽粒發(fā)育關(guān)鍵基因ZmRLK7的2 個靶位點目標DNA 區(qū)段序列進行了突變，編輯效率均為25%，為獲得穩(wěn)定的變異育種材料奠定了基礎(chǔ)。劉超等[22]從玉米自交系B73 基因組數(shù)據(jù)庫中篩選了3 個穗發(fā)育相關(guān)的玉米細胞分裂素氧化酶基因CKX4、CKX5和CKX10作為靶標基因，構(gòu)建了CRISPR/Cas9 玉米基因組編輯載體，為后續(xù)的玉米分子育種做了基礎(chǔ)工作。穆路遙[23]所在研究團隊在原有鑒定的3 個調(diào)控玉米百粒重的關(guān)鍵候選基因Zm079、Zm080、Zm081基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)獲得了與粒重相關(guān)的4 份編輯材料，影響穗長的3 份材料，影響株型的5 份材料，為玉米產(chǎn)量相關(guān)基因的探究奠定了堅實基礎(chǔ)。因此，玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀的基因編輯技術(shù)研究是核心的玉米分子育種目標。

2.3 品質(zhì)育種在玉米品質(zhì)改良方面的分子育種也是實現(xiàn)高質(zhì)量玉米品質(zhì)供給的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方向。張翔等[24]以玉米自交系京724 為受體材料，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，對玉米2 個香味同源基因ZmBADH2-1和ZmBADH2-2進行了突變，突變體材料中的香味物質(zhì)（2-AP）含量顯著提高，研究獲得了香型玉米種質(zhì)材料。祁顯濤等[25]通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對受體玉米材料的甜糯顯性基因Sh2和Wx1定點突變形成糯性隱性基因sh2和wx1，可以快速高效地創(chuàng)制甜糯玉米性狀的種質(zhì)材料。魏曉禹[26]以H99 玉米愈傷組織為受體材料，通過對轉(zhuǎn)化植株的分子檢測、農(nóng)藝性狀調(diào)查和后代種子的品質(zhì)性狀檢測，表明了ZmPCK2基因能夠控制玉米淀粉和蛋白質(zhì)含量，改良受體玉米材料的品質(zhì)。因此，在產(chǎn)量研究的基礎(chǔ)上能夠?qū)崿F(xiàn)CRISPR/Cas9 基因編輯改良玉米育種材料的品質(zhì)，對實現(xiàn)更加優(yōu)質(zhì)的玉米品種供給非常有價值。

2.4 抗逆育種玉米在整個生長過程中受到不同程度的生物和非生物脅迫，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在增強玉米抗旱、抗倒伏、抗除草劑和抗病等方面也有相關(guān)的研究成果報道。Shi 等[27]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)將克隆的玉米GOS2啟動子插入ARGOS8基因的5＇-UTR 或者替換ARGOS8基因的啟動子，得到了2 個過表達突變體材料ARGOS8-V1和ARGOS8-V2，與對照相比具有一定的抗旱性；Zhang 等[28]用過表達和CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)證實了stiff1基因影響玉米的莖稈強度，使得玉米莖稈細胞壁中的纖維素和木質(zhì)素含量發(fā)生變化，尤其是CRISPR/Cas9 實現(xiàn)基因敲除后玉米莖稈強度增強，具有顯著的抗倒伏性；Li 等[29]用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)實現(xiàn)了編碼乙酰乳酸合成酶基因ZmALS1和ZmALS2的編輯，改良了受體玉米材料的抗除草劑性狀，用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對ZmLOX3基因進行敲除后得到突變體材料對玉米黑粉菌的抗性顯著增強。

因此，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)進行功能基因驗證、產(chǎn)量育種、品質(zhì)育種和抗逆育種等方面的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，可以不斷明晰玉米相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)性狀，有效提升玉米材料的抗性，提升玉米產(chǎn)量和品質(zhì)，為選育適應(yīng)種植生長環(huán)境的優(yōu)良玉米品種提供分子育種技術(shù)支撐，同時還要在研究過程中考慮到以玉米為代表的作物基因編輯監(jiān)管問題。

3 基因編輯作物監(jiān)管

3.1 國際基因編輯監(jiān)管類型隨著基因編輯作物商業(yè)化進程的不斷加快，部分國家對其監(jiān)管的重視程度也顯著提高，基因編輯作物的研發(fā)和應(yīng)用需要有政府的監(jiān)管措施。目前，文獻報道了國際上存在的3 種監(jiān)管模式，都有相應(yīng)的法律和條例依據(jù)[30]。一是以美國和阿根廷為代表的寬松監(jiān)管，其與轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管不同，僅限于產(chǎn)品的監(jiān)管，但是做到了信息公開，監(jiān)管透明；二是以歐盟為代表的謹慎型監(jiān)管，認為與轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管實質(zhì)等同，要嚴格做到研發(fā)和應(yīng)用全過程監(jiān)管；三是以澳大利亞為代表的折中型監(jiān)管，在不同研發(fā)階段進行分類監(jiān)管。研究國外的監(jiān)管措施能夠?qū)ξ覈幕蚓庉嫳O(jiān)管政策起到借鑒的作用。

3.2 我國基因編輯監(jiān)管政策基因編輯產(chǎn)品監(jiān)管與基因編輯產(chǎn)品走向市場應(yīng)用具有很大的相關(guān)性。隨著我國基因編輯技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用不斷取得新的成果，我國基因編輯領(lǐng)域的科學(xué)家及團隊不斷建議，盡快建立包括玉米在內(nèi)的作物基因編輯監(jiān)管政策。因此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出了尊重科學(xué)、嚴格監(jiān)管，有序推進生物育種產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的具體要求。2022 年1月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了新修改的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》等規(guī)章的決定，還制定公布了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，主要針對沒有引入外源基因的基因編輯植物，依據(jù)可能產(chǎn)生的風(fēng)險申請安全評價過程。2023 年4 月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物評審細則（試行）》，主要從分子特征、環(huán)境安全、食用安全和評審程序4 個方面細化了基因編輯植物安全評價內(nèi)容，進一步明確了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評價指南（試行）》的可操作性。4 月28 日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《2023 年農(nóng)業(yè)基因編輯生物安全證書批準清單》，全國首個基因編輯安全證書獲批。這對規(guī)范我國農(nóng)業(yè)基因編輯的安全評價管理，促進我國作物育種技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有里程碑的意義。

3.3 監(jiān)管對策建議包括基因編輯玉米在內(nèi)的作物基因編輯研究都要有科學(xué)的研判，確保在安全可控的前提下，加速基因編輯作物研發(fā)和應(yīng)用。一是要加強對國際基因編輯監(jiān)管經(jīng)驗的吸收和借鑒；二是要進一步完善我國基因編輯作物的安全評價體系，做到全過程信息化管理并可溯源；三是要繼續(xù)推進我國基因編輯的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究，實現(xiàn)關(guān)鍵領(lǐng)域?qū)Α翱ú弊印钡耐黄疲瑢崿F(xiàn)國際領(lǐng)先水平，提升國際競爭力；四是要加大基因編輯技術(shù)的專利保護力度，不斷提升科學(xué)研究成果轉(zhuǎn)化效率；五是要加強生物技術(shù)的科學(xué)知識普及宣傳，積極營造科學(xué)認識CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)的良好社會氛圍。

綜上所述，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在玉米分子育種研究過程中取得了廣泛應(yīng)用，獲得了一批玉米育種材料，有效拓寬了玉米育種種質(zhì)資源。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，玉米功能基因的進一步挖掘和定點突變驗證，基因編輯技術(shù)將會進一步提升我國玉米分子育種成效。同時，要與其他分子育種技術(shù)相結(jié)合，與常規(guī)玉米育種技術(shù)相結(jié)合，為培育優(yōu)良的玉米新品種奠定基礎(chǔ)。還要加強科研院所和企業(yè)的研發(fā)合作和成果轉(zhuǎn)化，為我國玉米種業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展提供更加堅實的技術(shù)和人才支撐，不斷助力我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化。