張雪　孫悅　張超　婁熙源　羅懷英　文貴東　本智仁　陳雙龍

摘要：? 野生動(dòng)物糞便中激素含量可以間接反映其營養(yǎng)狀態(tài)，激素的檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于探究動(dòng)物的生理機(jī)能以及繁殖狀況。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）常用于類固醇激素的檢測(cè)，是近年來野生動(dòng)物激素檢測(cè)的重要手段之一，該方法樣品用量少，靈敏度高。2022 年6～7月在貴州省森林野生動(dòng)物園，運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了8只不同個(gè)體川金絲猴糞便中8種激素，比較了糞便中雌性以及雄性川金絲猴雌激素的差異。結(jié)果表明，甲狀腺素 T3、睪酮激素在8只個(gè)體中均未檢出。甲狀腺素 T4、氫化可的松均部分檢出。雌激素在8只個(gè)體中均檢測(cè)出。8只個(gè)體糞便雌二醇濃度平均值為 109.24 ng/ml，雌三醇濃度平均值為63.192 ng/ml，雌酮濃度平均值為87.77 ng/ml。 雌激素濃度在雌性和雄性個(gè)體間不存在顯著差異。研究工作可為后續(xù)川金絲猴的健康狀況及選育提供參考。

關(guān)鍵詞：? 川金絲猴；? 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；? 雌二醇

中圖分類號(hào)：? ?S 86; Q95? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：１００1 － 9499（２０23）03 － 0045 － 05

川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）屬于靈長目 （Primates）猴科 （Cercopithecidae）疣猴亞科 （Colobinae） 仰鼻猴屬（Rhinopithecus），是亞洲特有種，目前已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN） 列入瀕危物種紅色名錄瀕危等級(jí)（EN）， 在我國被列入國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄[ 1 ]。是主產(chǎn)于我國的珍稀靈長類物種，因其稀有性以及重要的生態(tài)、科研、文化和觀賞價(jià)值，列為國家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物和公約附錄物種。川金絲猴是典型的樹棲動(dòng)物，是我國華中和西南地區(qū)亞熱帶山地森林生態(tài)系統(tǒng)中最具代表性的物種之一[ 2 ]。對(duì)于川金絲猴生理狀況的探究有助于推動(dòng)川金絲猴的生態(tài)學(xué)、行為學(xué)、保護(hù)生物學(xué)以及馴養(yǎng)、繁殖、疾病和管理等方面的研究[ 3 - 6 ]。

皮質(zhì)類激素、生殖類激素、甲狀腺激素等內(nèi)分泌激素作為評(píng)價(jià)指標(biāo)回答有機(jī)體與生存和繁殖相關(guān)的問題[ 7 ]。雌激素主要包括雌二醇、雌三醇和雌酮化合物[ 8 ， 9 ]。在雌性動(dòng)物體內(nèi)，雌激素與孕激素協(xié)同作用，共同維持著雌性動(dòng)物生殖內(nèi)分泌的平衡，在促進(jìn)卵泡成熟、維持受精卵著床等發(fā)面發(fā)揮著重要作用[ 10 ]。非損傷性取樣方法（Noninvasive Sampling）是指在不捕捉、低干擾動(dòng)物正常活動(dòng)，甚至見不到動(dòng)物個(gè)體的情況下收集動(dòng)物脫落的毛發(fā)、糞便、尿液，含口腔脫落細(xì)胞的食物殘?jiān)Ⅶ[片以及卵殼等樣品進(jìn)行生物學(xué)研究的方法[ 11 ， 12 ]。野生動(dòng)物數(shù)量稀少，具有隱蔽性強(qiáng)、分布區(qū)偏僻、警覺性高等特點(diǎn)[ 13 - 15 ]。再者，對(duì)動(dòng)物的麻醉、捕捉、綁定等過程對(duì)動(dòng)物本身是一種劇烈的外界刺激，會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激[ 16 ]。因此，在近年的動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)研究中，非損傷性方法得到了廣泛的使用。通過采集尿液和糞便監(jiān)測(cè)動(dòng)物類固醇激素是目前最常用的非損傷采樣方法[ 17 ， 18 ]。同時(shí)，研究表明糞便類固醇激素與血液的研究結(jié)果存在一致性和直接對(duì)應(yīng)關(guān)系[ 19 ]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，用于復(fù)雜樣品分析檢測(cè)，可省去分離純化代謝物樣品的繁瑣步驟[ 20 ]。圈養(yǎng)川金絲猴生活的空間和環(huán)境受限制，且常與人類近距離接觸，長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。本研究運(yùn)用HPLC-MS/MS對(duì)雌雄川金絲猴糞便8種激素水平測(cè)定，探究雌雄川金絲猴糞便中8種激素含量及川金絲猴雌性和雄性個(gè)體雌激素含量的差異性。結(jié)合生理指標(biāo)更全面的評(píng)價(jià)川金絲猴的生存、健康以及繁殖狀況等，旨在為圈養(yǎng)川金絲猴生理健康狀況提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 研究方法

1. 1 研究地點(diǎn)與對(duì)象

研究地點(diǎn)為貴州省森林野生動(dòng)物園，位于貴州省修文縣扎佐鎮(zhèn)林場(chǎng)冷水溝分場(chǎng)內(nèi)，總占地面積約5 000余畝。野生動(dòng)物園依托園區(qū)內(nèi)緩坡、山坳、寬谷、石林等多種喀斯特地貌，按照不同動(dòng)物的生態(tài)要求，因地制宜、合理布局。本研究的觀察地點(diǎn)為靈長類展區(qū)川金絲猴籠舍?；\舍均由內(nèi)、外兩個(gè)籠舍組成，四面都是玻璃幕墻，頂部用鐵網(wǎng)固定，以便透氣通風(fēng)。研究對(duì)象為8 只成年及幼年川金絲猴，包括2只雄性（Male，n=2）和6只雌性（Female，n=6）個(gè)體。

1. 2 糞便樣品的采集與

2022 年6～7月在貴州省森林野生動(dòng)物園內(nèi)對(duì)川金絲猴進(jìn)行觀察，采集被觀察個(gè)體的新鮮糞便。觀察到其排便后立即由飼養(yǎng)員用一次性PE手套采集糞便樣本。為了最大限度地減少環(huán)境污染，只收集糞便的內(nèi)部部分作為樣本。將所有新鮮糞便樣本收集到40 ml無菌RNA管中。隨后將樣品儲(chǔ)存在-80℃冰箱里，直到測(cè)試分析。

1. 3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測(cè)定糞便激素

1. 3. 1 試劑、耗材、標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)驗(yàn)儀器

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑甲狀腺素 T3、甲狀腺素 T4、黃體酮（孕酮）、氫化可的松（糖皮質(zhì)素）、睪酮、雌酮、雌二醇、雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品（購自源葉生物）、色譜級(jí)甲醇、乙腈（購自德國默克）。主要實(shí)驗(yàn)儀器為TG-16G 臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、FA1204? ?電子天平（上海衡際科學(xué)儀器有限公司）、AGLIENT1260 高效液相色譜儀串聯(lián) 6420A 質(zhì)譜儀（安捷倫公司）。

1. 3. 2 樣品提取方法

（1）取糞便樣品 0.4 g，加入色譜級(jí)甲醇 5 ml，漩渦震蕩 1 min；

（2）4 ℃，水浴超聲 5 min，4 ℃，10 000 g 離心 1 min，取上清；

（3）沉淀再加入色譜級(jí)乙酸乙酯 ml，重新提取一次；

（4）4 ℃，10 000 g 離心 1 min，取上清液，合并兩次上清；

（5）氮?dú)獯蹈杉状?，?0.2 ml PBS-BSA 重懸；

（6）過 0.22 μm 濾膜，進(jìn)液質(zhì)檢測(cè)。

1. 3. 3 液質(zhì)條件

色譜柱：Agilent ZORBAXSB-C18 反相色譜柱（2.1×150，3.5 μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水；B：甲醇。流速：0.3 ml/min。進(jìn)樣體積：5 μl。動(dòng)物激素的離子、解簇電壓、碰撞能量等參數(shù)如表 1 所示，反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件如表2 所示。

儀器所測(cè)得濃度為最終提取液的濃度，經(jīng)計(jì)算獲得原樣品中激素濃度，計(jì)算方法如下： 樣品中激素濃度（ng/g）=檢測(cè)濃度（ng/ml）×稀釋體積（ml）/稱取質(zhì)量（g）。其中稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時(shí)所用的溶液體積，稱取質(zhì)量為提取時(shí)的取樣質(zhì)量。檢測(cè)濃度由待測(cè)物質(zhì)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)方程，由儀器自動(dòng)求得。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用 SPSS v.22.0（IBM corp.， Armonk， NY， USA）統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，對(duì)于雌性和雄性的川金絲猴糞便激素濃度進(jìn)行差異顯著性比較，比較之前都通過單一樣本 K-S 檢驗(yàn)（one-sample Kolmogorov-Smirnov test）進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。對(duì)不同樣品中測(cè)得的川金絲猴糞便激素濃度進(jìn)行兩個(gè)變量的Pearson 相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 線性范圍

8種川金絲猴糞便激素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示。檢測(cè)濃度由待測(cè)物質(zhì)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)方程。

2. 2 川金絲猴糞便激素水平

不同川金絲猴8個(gè)體糞便檢測(cè)出的激素結(jié)果有差異（表4）。甲狀腺素 T3、睪酮激素在8只個(gè)體中均未檢出；甲狀腺素 T4、氫化可的松均部分檢出；三種雌激素在8只個(gè)體中均檢測(cè)出。8只個(gè)體糞便雌二醇濃度平均值為 109.24（ng/ml），雌三醇濃度平均值為63.192（ng/ml），雌酮濃度平均值為87.77（ng/ml）。雌激素中以雌二醇的生物活性最高，選取雌二醇、雌三醇、雌酮濃度運(yùn)用Spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，對(duì)于雌性和雄性川金絲猴的雌酮、雌二醇、雌三醇激素濃度進(jìn)行差異顯著性比較，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。在t檢驗(yàn)之前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，差值95%置信區(qū)間。結(jié)果顯示：雌酮、雌二醇、雌三醇激素濃度均滿足方差齊性檢驗(yàn)（P>0.05）。結(jié)果（表5）表明，雌酮濃度、雌二醇濃度、雌三醇濃度在雌性和雄性個(gè)體間不存在顯著差異（P>0.05）。

3 討 論

本研究結(jié)果與其他靈長類動(dòng)物雌激素之間相關(guān)性研究結(jié)果相似，在短尾猴（Macaca thibetana）的研究中也顯示雌性和雄性雌激素?zé)o顯著差異[ 21 ]。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素、睪酮、氫化可的松在糞便中未檢出，這可能是由于激素保存具有時(shí)效性，收集到的新鮮糞便如果不能及時(shí)提取處理或低溫保存，常溫下糞樣內(nèi)及外界的微生物會(huì)在短時(shí)間內(nèi)分解其中的各種類固醇激素，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的偏差[ 22 ]。在本次研究中由于貴州省野生動(dòng)物園內(nèi)川金絲猴個(gè)體數(shù)量有限，且采樣季節(jié)較為單一，樣品的連續(xù)性不高，無法確定雌二醇濃度峰值出現(xiàn)時(shí)期，在幾個(gè)月內(nèi)川金絲猴激素水平的變化趨勢(shì)是未知的。由于川金絲猴排泄時(shí)間波動(dòng)較大，川金絲猴種群受到食物供給、游客影響以及疾病和人為干擾等方面影響，可能給本研究結(jié)果的可信性帶來一定的影響。圈養(yǎng)川金絲猴受到游客的影響導(dǎo)致其長期處于應(yīng)激狀態(tài)，在圈養(yǎng)保護(hù)時(shí)應(yīng)盡量減少人為接觸，多進(jìn)行安撫[ 23 ]。糞便在川金絲猴體內(nèi)停留時(shí)間較長[ 24 ， 25 ]，激素受腸道微生物和細(xì)菌的干擾，其濃度容易受到影響[ 26 ]。糞便中激素的濃度與動(dòng)物的行為并不完全一致[ 27 ]，因此有必要驗(yàn)證動(dòng)物糞便和尿液中激素水平的相關(guān)性[ 28 ， 29 ]。例如吼猴（Alouatta pigra）糞便通過腸道的時(shí)間一般為23～30 h，最長時(shí)間可以達(dá)到72 h[ 30 ]，所以應(yīng)用糞便類激素探討動(dòng)物行為等方面研究需要進(jìn)一步研究。雌激素與繁殖期行為的相關(guān)性以及川金絲猴在生活史不同時(shí)期，如妊娠期、哺乳期等時(shí)期的性激素水平等還有待進(jìn)一步的分析研究。

本研究及結(jié)果說明非損傷技術(shù)手段可以很好的應(yīng)用到川金絲猴的生理狀況研究中。利用非損傷的研究技術(shù)和HPLC-MS/MS測(cè)定技術(shù)應(yīng)用于生理、免疫以及能量代謝等方面的影響更加具有保護(hù)生物學(xué)意義。本研究為川金絲猴體內(nèi)激素在糞便，尿液或血液中的相互關(guān)系提供基礎(chǔ)。糞便或者尿液中激素的檢測(cè)分析，將為靈長類對(duì)環(huán)境的生理適應(yīng)機(jī)制提供平臺(tái)，對(duì)珍稀瀕危靈長類保護(hù)具有重要的意義。利用非損傷研究方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)野生動(dòng)物生理激素水平的監(jiān)測(cè)，一定意義上加速了內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展。

致謝：感謝貴州森林野生動(dòng)物園工作人員在采樣期間對(duì)本研究的支持和幫助。感謝貴州省特色微生物資源開發(fā)應(yīng)用平臺(tái)對(duì)本研究的支持，特此致謝。

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