張佳玉 滕培英 呂維民 楊 帆 陳 偉

（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是由多種腸道病毒感染引起的兒童急性傳染病。HFMD 的病原體為小核糖核酸病毒科，有20 多種（型），主要包括腸道病毒71 型（enterovirus type 71，EV71）、柯薩奇病毒（coxsackievirus，CV）A群和B 群以及?？刹《荆╡nteric cytopathic human orphan virus，ECHO）等［1］。近年來，越來越多證據(jù)表明，柯薩奇病毒B 組5 型（coxsackievirus B5，CVB5）逐漸成為手足口病的重要病原體之一［2-3］?；颊吒腥綜VB5 后，出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹或皰疹等癥狀，重癥者還會(huì)出現(xiàn)以病毒性腦炎和無菌性腦膜炎為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至死亡，對嬰幼兒健康造成嚴(yán)重威脅［4］。

CVB5 為無包膜的單股正鏈RNA（+ssRNA）病毒，基因組全長約7 400 bp，由1 個(gè)開放閱讀框及2 個(gè)非翻譯區(qū)構(gòu)成，可編碼2 194 個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，并進(jìn)一步水解為3 個(gè)前體蛋白（P1、P2、P3）。P1 前體蛋白基因編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3 和VP4），主要負(fù)責(zé)病毒核衣殼的組裝，其中VP1 基因具有主要的中和抗原決定簇，是腸道病毒血清學(xué)分型的重要依據(jù)。P2 和P3基因區(qū)編碼的7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，NSP）（2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D）在病毒復(fù)制、細(xì)胞自噬和逃逸天然免疫中發(fā)揮了重要作用［5］（圖1）。

核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是宿主天然免疫反應(yīng)中的重要蛋白質(zhì)，由5個(gè)家族成員組成（p65/RelA、RelB、cREL、p50 和p52），在宿主的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB/Rel 轉(zhuǎn) 錄 因 子 與 核 因 子κB 抑 制 蛋 白（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復(fù)合物，以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)RNA 病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞表面特異性受體識別和激活，活化下游接頭蛋白，激活NF-κB介導(dǎo)的信號通路。IκBα在Ser32和Ser36 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而被蛋白酶體降解，從而活化NF-κB釋放［6］。激活的轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)下游炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6 等） 的 表 達(dá)，進(jìn) 而 發(fā) 揮 抗 病 毒效應(yīng)［7-8］。

本研究將探索CVB5感染人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì) 胞（human rhabdomyoma cells， RD） 后 對NF-κB信號通路的影響，并進(jìn)一步闡明CVB5 NSP在通路中的調(diào)控作用，同時(shí)揭示與CVB5 3CD互作蛋白的初步功能。本研究不僅有助于探索CVB5對宿主天然免疫應(yīng)答的調(diào)控作用，也為CVB5治療性藥物的研究奠定基礎(chǔ)。

Fig. 1 CVB5 structure pattern and genome structure

Fig. 2 CVB5 negatively regulates NF-κB signaling pathway

Fig. 3 Digestion validation of eukaryotic expression vector plasmid pcDNA3.1-2B/2C/3AB/3C/3D

Fig. 4 Effects of CVB5 NSP on NF-κB pathway

Fig. 5 Effect of PCBP1 on virus replication

1 材料與方法

1.1 試劑

RNAiso Plus （Takara 公 司）；Hifair?II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（翌圣生物科技上海股份有限公司）；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；人白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒、人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒、人白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（江蘇酶免）；質(zhì)粒提取試劑盒（Sigma）；GAPDH 抗體、α-tubulin抗體、Flag 抗體以及鼠/兔二抗（愛博泰克生物科技有限公司）；NF-κB 通路主要蛋白質(zhì)抗體（p65、IκBα、 p-p65、 p-IκBα、 p52、 p100） （Cell Signaling Technology）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染

RD 細(xì) 胞（American Type Culture Collection，CCL-136） 在 含 有10% 胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。

利用增殖狀況良好的RD細(xì)胞接種不同稀釋度的CVB5， 在3~7 d 后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），根據(jù)Reed Mench法測定CVB5 滴度［9］。隨后CVB5 感染RD 細(xì)胞9 h，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為5，分別收取細(xì)胞上清及沉淀。

1.3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

利用Trizol 法提取CVB5 基因組RNA，根據(jù)CVB5 NSP特異性引物（表1），通過RT-PCR方法、酶切、瓊脂糖凝膠回收和連接轉(zhuǎn)化等方法構(gòu)建pcDNA3.1-2B、 pcDNA3.1-2C、 pcDNA3.1-3AB、pcDNA3.1-3C 和pcDNA3.1-3D 5 個(gè)真核表達(dá)載體，并進(jìn)行測序鑒定。

RD 細(xì)胞以2×106個(gè)/孔的密度接種6 孔板，分別轉(zhuǎn)染上述構(gòu)建成功的CVB5 NSP 真核表達(dá)質(zhì)粒24 h（以pcDNA3.1空載為對照）后，CVB5（MOI=5）感染9 h，分別收取細(xì)胞上清及沉淀。

Table 1 Primers used in this study

1.4 促炎因子表達(dá)的檢測

利用Trizol 法提取細(xì)胞沉淀中總RNA。RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA 的步驟參照Hifair?III SuperMix，程序?yàn)椋?2℃ 2 min 去除DNA，25℃ 5 min→55℃15 min→85℃ 5 min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR，程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 5 min，95℃ 10 s→60℃ 34 s（40 個(gè)循環(huán)），以GAPDH 作為內(nèi)參基因（引物序列見表1）；同時(shí)，采用ELISA試劑盒，對上清液中促炎因子的含量進(jìn)行定量分析。

1.5 免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)

利用RIPA 裂解液提取細(xì)胞沉淀中總蛋白質(zhì)，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%脫脂牛奶或2%BSA 封閉2 h，TBST 清洗3次；一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次；常溫中二抗孵育2 h，TBST清洗3次；ECL試劑進(jìn)行顯影。

1.6 NF-κB啟動(dòng)子活性檢測

將報(bào)告基因質(zhì)粒（p-NF-κB-Luc 與pRL-TK 以10∶1 混合）與CVB5 NSP 真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RD 細(xì)胞后，CVB5（MOI=5）感染9 h。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值為標(biāo)準(zhǔn)，檢測NF-κB啟動(dòng)子的活性。

1.7 蛋白質(zhì)相互作用的預(yù)測與分析

利用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，選出與CVB5 3CD 的互作候選蛋白。同1.3 節(jié)，通過PCR方法、KpnI/NotI酶切、瓊脂糖凝膠回收和連接轉(zhuǎn)化等方法構(gòu)建pCDNA3.1-PCBP1 真核表達(dá)載體，并測序驗(yàn)證。利用1.4和1.5節(jié)檢測其對CVB5 VP1表達(dá)的影響，同時(shí)檢測互作蛋白對NF-κB 通路的影響。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1）。

2 結(jié) 果

2.1 CVB5負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路

CVB5感染RD細(xì)胞，NF-κB亞基p65的mRNA表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)p65 蛋白的磷酸化水平降低（圖2a）；同時(shí)，對NF-κB 通路下游的促炎因子檢測發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢（圖2b）。綜上所述，CVB5感染宿主細(xì)胞后，可負(fù)調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的天然免疫信號通路。

2.2 成功構(gòu)建CVB5 NSP真核表達(dá)載體

如圖3 所示：pcDNA3.1-2B、pcDNA3.1-2C、pcDNA3.1-3AB 3 個(gè)真核表達(dá)載體采用BamH I 和EcoR I 酶切驗(yàn)證，酶切后片段大小分別為294 bp、987 bp、 333 bp， 與 目 的 序 列 大 小 相 符；pcDNA3.1-3C 和pcDNA3.1-3D 兩個(gè)真核表達(dá)載體采用BamH I和XhoI酶切驗(yàn)證，酶切后片段大小分別為552 bp 和1 386 bp。同時(shí)，上述5 個(gè)真核表達(dá)載體測序結(jié)果正確。上述結(jié)果表明，CVB5 NSP真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 CVB5 NSP抑制NF-κB信號通路

為進(jìn)一步闡明CVB5 NSP在NF-κB通路中的作用，我們分別從啟動(dòng)子活性、促炎因子表達(dá)以及蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測。如圖4a結(jié)果所示，CVB5 NSP均可抑制NF-κB通路的啟動(dòng)子活性，其中2C和3C對通路啟動(dòng)子活性的抑制作用較為顯著；qRT-PCR檢測促炎因子水平表明，非結(jié)構(gòu)蛋白較為顯著的抑制促炎因子的表達(dá)（圖4b-d）；通過Western blot對NF-κB 信 號 通 路 中 的 關(guān) 鍵 蛋 白（p65、IκBα、p-p65、p-IκBα）檢測表明（圖4e），3C 和3D 蛋白顯著下調(diào)了通路中關(guān)鍵蛋白p65 和IκBα 的磷酸化水平。

2.4 3CD互作蛋白PCBP1功能分析

以對促炎因子表達(dá)具有顯著調(diào)控作用的CVB5 3CD 為候選蛋白，使用STRING 分析得出與3CD互作的候選蛋白多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白（PCBP1）。在體外，PCBP1的過表達(dá)成功（圖5a）；同時(shí)檢測其對CVB5 病毒復(fù)制的影響，如圖5b 和5c 所示，PCBP1 可抑制病毒復(fù)制。同時(shí)，進(jìn)一步檢測了PCBP1對NF-κB通路的影響（圖5d），PCBP1可促進(jìn)p65 以及IκBα 的磷酸化水平，對NF-κB 起正調(diào)控作用，提示PCBP1 可能促進(jìn)NF-κB 信號通路的激活以抑制病毒復(fù)制。

3 討 論

CVB5可通過糞口途徑感染機(jī)體，從而導(dǎo)致了不同類型的疾病。此外，據(jù)報(bào)道，CVB5也可通過呼吸道感染人體，引起肺炎和哮喘，同時(shí)可分泌細(xì)胞因子RANTES、IL-8和MCP-1。這3種細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子的上游均含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，并受NF-κB的調(diào)控［10-12］。那么，關(guān)于CVB5感染細(xì)胞后是否能夠調(diào)控NF-κB信號通路？本研究結(jié)果表明，CVB5 感染RD 細(xì)胞后，可以降低細(xì)胞內(nèi)的NF-κB 亞基p65 的mRNA 拷貝數(shù)及蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)抑制NF-κB信號通路下游促炎因子的表達(dá)。由此可知，CVB5能夠抑制NF-κB激活的天然免疫信號通路。

病毒的感染和宿主的免疫應(yīng)答是一場博弈，其中天然免疫是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡清除感染的病毒的第一步。病毒感染細(xì)胞后，其核酸開始復(fù)制和翻譯，合成了具有酶活性的NSP，從而可阻斷受體識別的信號通路，使病毒逃逸天然免疫應(yīng)答［13］。如對于引起HFMD 的重要病原體EV71 和CVA16 的NSP 研究表明，EV71 3Cpro可通過與視黃酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acid-induced gene I，RIG-I）結(jié)合，從而阻斷與下游接頭蛋白的結(jié)合，進(jìn)而抑制促炎因子的產(chǎn)生，使病毒逃逸天然免疫應(yīng)答［14］，CVA16 3C蛋白與RIG-I N 端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，破壞RIG-I 與線粒體抗病毒信號蛋白之間相互作用，降低了IRF3 的激活，從而導(dǎo)致IFN-I 信號被阻斷［15-16］。此外，對于其他病毒如藍(lán)舌病毒（BTV）的NS3［17］、流感病毒的NS1［18］等非結(jié)構(gòu)蛋白也具有類似的功能。因此，本文對CVB5 NSP在NF-κB通路中的作用進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明，CVB5 NSP 具有抑制NF-κB通路的作用。由于非結(jié)構(gòu)蛋白對促炎因子的影響顯著，因此，本文選取了對蛋白質(zhì)表達(dá)影響最為顯著的3C和3D蛋白的前體蛋白3CD作為候選蛋白，篩選與其互作的蛋白質(zhì)。

3C 蛋白是糜蛋白酶樣的半胱氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)病毒多聚蛋白的切割過程［19］。晶體結(jié)構(gòu)和誘變研究表明，與3C 蛋白結(jié)合的裂縫存在一個(gè)包含β結(jié)構(gòu)的非極性表面環(huán)，有助于底物的識別和的催化活性［20］。3D 蛋白是病毒編碼的RNA 依賴型RNA聚 合 酶 （RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），是RNA 復(fù)制合成基因組的催化成分，在小RNA 病毒的生命周期中發(fā)揮著重要作用［21-22］。3CD 是由小RNA 病毒主要加工途徑產(chǎn)生的多功能前體蛋白，具有蛋白酶和RNA 結(jié)合活性，可參與復(fù)制細(xì)胞器的形成和病毒顆粒的組裝［23］。本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析，篩選得到與3CD蛋白互作的候選蛋白PCBP1。PCBP1 是一種RNA 結(jié)合蛋白，此前有報(bào)道其可與丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)結(jié)合，并可以抑制丙型肝炎病毒粒子的組裝和分泌［24］。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，PCBP1可促進(jìn)IκBα和p65磷酸化，抑制病毒復(fù)制。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了CVB5 NSP的真核表達(dá)載體，并初步研究了CVB5 NSP對NF-κB信號通路的調(diào)控作用。同時(shí)進(jìn)一步揭示了與CVB5 3CD互作的PCBP1蛋白抑制病毒復(fù)制作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步探究CVB5感染機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。