徐永艷李 昆焦 蓉汪 瓊王春濤郁步竹徐 榮

（1. 西南林業(yè)大學園林園藝學院，國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術研究中心，云南 昆明 650233；2. 中國林業(yè)科學研究院高原林業(yè)研究所，云南 昆明 650233；3. 玉溪師范學院，云南 玉溪 653100）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）是云南道地稀缺名貴藥材，通常以干燥根莖入藥，具有消腫止痛、清熱解毒、涼肝定驚、免疫調(diào)節(jié)等多種功效[1]，近年研究發(fā)現(xiàn)其對多種類型的腫瘤具有非常好的治療效果，是云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片等中成藥的主要原料[2]。滇重樓作為重要的中成藥原料，目前已經(jīng)分離和鑒定了甾醇及苷類、氨基酸、脂肪酸、多糖、黃酮等50 多種成分，其主要有效成分為甾體皂苷[3]。2015 年版《中國藥典》規(guī)定滇重樓的含量標準為薯蕷皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ）和偏諾皂苷（重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ）總含量≥0.60%[4]。近年來隨著滇重樓藥用范圍不斷擴大，每年消耗量遠超出年再生能力，加之滇重樓根莖生長周期漫長、生長速度緩慢的特點，仍制約著人工種植業(yè)的發(fā)展[5]。此外，滇重樓皂苷合成分子機制尚不清楚，其產(chǎn)量及有效成分甾體皂苷含量無法短時期內(nèi)提升，供不應求的窘迫現(xiàn)狀仍未根本上得以改善[6]。

滇重樓傳統(tǒng)入藥部分為根莖，其地上部分的藥用價值鮮有利用，在原材料極度缺乏的形勢下，測定根莖以外其他組織器官如葉片、地上莖、新芽、花、須根、果皮、種子中總皂苷含量，可為充分利用滇重樓資源提供參考[7]。中藥材有效成分積累是一個漸進的過程，主根等器官在不同生長年限所含皂苷單體種類及含量不盡相同，不同生長階段皂苷單體種類及其含量也有所差別[8]。由此可見，重樓皂苷積累具備明顯的時空特征，但是該特征迄今在國內(nèi)外未見系統(tǒng)報道。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定滇重樓同一生長年限不同器官和同一器官在不同生長發(fā)育時期皂苷種類及其含量，總結重樓皂苷在植物生長過程中的時空變異和積累規(guī)律，可為滇重樓器官采收期的科學確定和滇重樓器官的綜合、合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取前期篩選重樓皂苷含量較高、生長較快、云南普洱景東地理種源的滇重樓作為研究對象，選取30 株健壯7 年生植株于2020 年3 月定植在西南林業(yè)大學樹木園苗圃（云南，昆明）；采用70%遮陰網(wǎng)遮陰，統(tǒng)一水肥管理。經(jīng)西南林業(yè)大學曾覺民教授鑒定為滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）。按不同組織、生長季節(jié)分別取樣，進行重樓皂苷含量測定。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀：G1322A脫氣機、G1311A 泵、G1313A 進樣器、G1316A 柱溫箱、G1315B 檢測器；KQ-500E 型超聲波清洗儀；METRotavapor RⅡ旋轉蒸發(fā)儀；精度為0.01 g的天平。

1.2.2 試劑

重樓皂苷Ⅰ（YJ-111591）、皂苷Ⅱ（YJ-111592）、皂苷Ⅵ（YJ-111593）和皂苷Ⅶ（YJ-111594）4 種對照品均從中國藥品生物制品檢定所購買，供含量測定用。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1 滇重樓根莖1～5 a 齡段中皂苷含量的差異性分析

2020 年7 月隨機選取滇重樓樣株根莖1 年生、2 年生、3 年生、4 年生和5 年生部分切下，根莖的1 年生、2 年生等各組織區(qū)分見圖1，本研究用根莖1～7 a 齡段表示。相同部位混樣60 ℃烘干，加熱回流法[9]提取總皂苷，采用高效液相法[10]測定各樣品皂苷含量，設3 次重復。線性關系考察表明各標準品范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系；精密度試驗RSD 結果為0.39%，說明所采用儀器精密度良好；RSD 的結果表明供試品的溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好、方法重復性良好。

圖 1 7 年生滇重樓根莖Fig. 1 A sketch of rhizome and stem of 7-year-oldP. polyphyllavar. yunnanensis

1.3.2 滇重樓不同組織器官中皂苷含量比較分析

測定比較根莖、葉片、地上莖、新芽、花、須根、果皮、種子等不同組織器官的重樓皂苷含量，2020 年7 月隨機采樣混樣干燥后進行皂苷含量測定，3 次重復。

1.3.3 不同生長期滇重樓根莖皂苷含量的比較分析

分別于2020 年7 月、9 月、11 月底和2021年1 月、3 月、5 月底取樣，隨機取滇重樓樣株根莖1 a 齡段混勻干燥后測定皂苷含量，3 次重復。

2 結果與分析

2.1 滇重樓不同年限根莖及其他組織累積皂苷含量的比較分析

滇重樓總皂苷成分以重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ為主，重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ為輔（表1、圖2）。滇重樓中總皂苷集中于根莖部位，含量在7.1～15.7 mg/g 之間，2 a 齡段根莖含量最高，須根、莖、葉、花、芽、果皮、種子等器官中也檢測到重樓皂苷，其含量在0.7～5.7 mg/g 之間，皂苷最高含量是最低含量的22.4 倍。滇重樓根部總皂苷含量高于其他組織器官，達到了顯著差異水平（P＜0.05），不同生長年齡的滇重樓根部總皂苷含量差異顯著（P＜0.05），根莖1 a 齡段的皂苷含量最低，根莖2 a 齡段含量最高。通過方差分析和多重比較可知，普洱景東種源滇重樓根莖4 a 齡段和根莖5 a 齡段兩者之間差異不顯著，其他不同組織器官兩兩之間的總皂苷含量均顯著差異（P＜0.05）。

表 1 不同年限根莖及其他組織重樓皂苷的含量Table 1 Contents of saponins in the samples collected in different growth years of rhizome and other tissue

圖 2 不同生長年限根莖及其他組織重樓皂苷含量HPLC 圖譜Fig. 2 HPLC chromatograms in the samples collected in different growth years of rhizome and other tissue

2.2 不同生長發(fā)育期根莖皂苷累積的比較分析

通過觀察景東種源滇重樓，總結其年生長規(guī)律如下：1 月（休眠期）、3 月（地上部分即將萌動）、5 月（花期）、7 月（結實期）、9 月（果實膨大期）、11 月（倒桿期）、1 月（休眠期）。通常植物在花期、果期會消耗大量養(yǎng)分，滇重樓的地上、地下生長高峰期交替進行，9 月前后，新芽（下1 年的莖葉）形成，滇重樓開始進入地下根莖快速生長期，12 月前后倒桿進入休眠期。該種源生長期長，倒桿時間比其他種源晚。

滇重樓1 年生根莖在不同生長發(fā)育期總皂苷成分以薯蕷類重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ為主（表2、圖3）?？傇碥蘸吭? 月最高達8.655 mg/g，在5—11 月花果期總皂苷含量最低為6.117 mg/g。3 月底滇重樓已經(jīng)完成了花芽分化，皂苷含量開始降低為7.922 mg/g，4 月其莖葉和花蕾同時出土，5 月開花皂苷含量持續(xù)降低至最低點6.117 mg/g，之后7 月結實期提高為7.155 mg/g，9 月果實膨大期又降低為6.285 mg/g，11 月倒桿期皂苷含量有所升高為6.961 mg/g。其中，景東種源滇重樓5 月和9 月、7 月和11 月的總皂苷含量差異不顯著，1 月、3 月皂苷含量與其他時期均差異顯著（P＜0.05）。

表 2 植株不同生長期重樓皂苷的含量Table 2 Contents of saponins in the samples collected in different growth stages

圖 3 不同生長時期重樓皂苷含量的HPLC 圖譜Fig. 3 HPLC chromatograms of saponins contents in the samples collected in different growth stages

3 結論與討論

本研究結果表明，滇重樓根莖、須根、莖、葉、花、芽、果皮、種子等器官均檢測到重樓皂苷，根莖作為傳統(tǒng)藥用部位皂苷含量最高，基本均超過0.6%，葉片、須根、莖、花、芽、果皮和種子等部位均檢測到重樓皂苷，含量從高到低排列為：根莖＞葉＞種子＞芽＞莖＞須根＞果皮＞花。除根莖外的其他部位的皂苷含量均未超過0.6%，但整個植株仍然具有開發(fā)利用價值，尤其是葉中總皂苷含量達0.16%～0.52%，建議提取利用。滇重樓根莖中2 a 齡段含量最高，隨年份增加而降低，該結果與其他文獻3 年生最高不同[11]，可能因為本試驗中是取7 年生植株的兩年生部位導致。推測皂苷從前體到合成需要較長時間，葉片是重樓皂苷的重要合成部位，合成后輸送到根莖部儲存，重樓根莖為重樓皂苷的“庫”。與馮麗麗等[12]提出的重樓皂苷主要在植物葉綠體中合成，從地上部位向下運輸主要在根莖和葉中儲存的觀點一致，也解釋了葉中總皂苷含量相對較高的原因。本研究顯示在不同生長年限根莖中，皂苷含量從高到低依次為2 a 齡段、3 a 齡段、4～5 a 齡段、1 a 齡段，與傳統(tǒng)認知的7 a 左右為最佳采收期差距甚遠，同一植株根莖皂苷含量在2 年生部位達到最高值，隨年限增加呈遞減趨勢，推測重樓皂苷代謝為邊合成、邊分解的動態(tài)過程，達到某個閾值時，開始分解，有待于后期通過分子生物學手段進行驗證。

本研究測定不同生長季節(jié)總皂苷含量高低變化規(guī)律為1 月＞3 月＞5 月、9 月＞7 月、11 月，花期和果期皂苷含量較低，與夏從龍等[13]測定的滇重樓在5 月、6 月份花期的皂甙含量最高，9 月、10 月份果期最低的結果不一致，可能因植物材料、栽培地的地域性及生態(tài)環(huán)境條件不同導致。但與西洋參測定的休眠期高于花果期皂苷含量的結果一致[14]，推測滇重樓花果期生殖生長消耗大量養(yǎng)分導致皂苷含量低。植物休眠期通常要完成花芽分化、生理后熟等重要生理活動[15-16]，1 月前后的休眠季節(jié)皂苷含量最高，可能是皂苷合成的中間產(chǎn)物轉化為重樓皂苷。宜對不同生長期重樓皂苷合成主要基因同時進行qPCR 測定，與皂苷含量進行相關性分析，可以更加深入地從分子層面解析重樓皂苷的累積規(guī)律。前人研究認為甾體皂苷合成有甲羥戊酸通路（MVA）和非甲羥戊酸通路（MEP），MVA 為主要通路[17]。甾體皂苷骨架生物合成最后由β-糖苷酶與甾體糖基轉移酶催化形成多種甾體皂苷[18]。尼二磷酸合成酶、鯊烯環(huán)氧酶、鯊烯合成酶等多種酶參與甾體皂苷合成[19]，環(huán)阿屯醇合酶（CAS）和鯊烯合酶（SQS）是滇重樓的主要有效成分甾體皂苷（三萜類物質(zhì)）合成通路中的關鍵酶[20]。為進一步明確滇重樓皂苷合成通路，后期將利用高通量轉錄組測序，對滇重樓不同季節(jié)、不同組織器官進行分析。以期挖掘滇重樓皂苷合成通路中的關鍵基因并揭示其調(diào)控機制，為利用現(xiàn)代生物技術的基因調(diào)控手段提高滇重樓皂苷含量提供基礎。

采收期是影響中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)之一，生產(chǎn)中滇重樓的最佳采收年限應綜合根莖增長速率和皂苷增加速率來決定，選取經(jīng)濟效益最高時采收為宜，明確滇重樓器官皂苷積累時空特征具有重要意義。由于滇重樓資源日漸枯竭，葉中總皂苷含量達0.16%～0.52%，可部分替代根莖入藥緩解供需矛盾。因此，本研究探討了滇重樓根莖在不同生長年限、不同生長發(fā)育期及不同器官的總皂苷含量規(guī)律，可為生產(chǎn)中最佳采收期的確定和滇重樓器官的綜合、合理利用提供科學依據(jù)。