李 英,張貽楊,岳林濤,戴明珠,沈佳琪,郭 杰,李春啟

(1.山西振東制藥股份有限公司,山西 長治 046000;2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司,浙江 杭州 310051)

中國歷代醫(yī)書中均有以茶入藥的記載,最早對茶的藥用價值記載見首部官修藥典《新修本草》?！八幉琛备拍畹男纬膳c流傳主要與唐代茶文化和食療文化的發(fā)展有關。目前,藥茶已逐漸轉變?yōu)榫哂休o助功效的飲品[1-3]。靈芝參芪茶由靈芝、黨參、黃芪、黃精和陳皮共五味中藥材配伍而成。享有“仙草”美譽的靈芝,味甘、性平,主治虛勞癥[4-6],除了補益功效外,現(xiàn)代藥理作用還表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜安定、抗衰老和調節(jié)免疫等[7-9]?！侗静菡x》曾論述黨參“本與人參不甚相遠”,味甘、性平,主治脾胃虛弱、氣血兩虧、體倦無力,具有增強免疫、抗疲勞、調節(jié)糖脂代謝和改善心血管系統(tǒng)功能等藥理作用[10-11]。黃精可抗疲勞、抗病原微生物和抗氧化;黃芪補氣固表,拔毒排膿,利尿[12]。而陳皮味苦、辛,性溫,用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多。五味藥材按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥“君臣佐使”理論,適用于抗疲勞和肺虛咳嗽。

葛根枳椇茶由葛根、枳椇子、蒲公英和山藥四味中藥材組成。葛根含黃酮、葛根素和大豆黃酮等,味甘、辛,性涼,用于表證發(fā)熱、麻疹不透、熱病口渴;枳椇子含有三萜類、黃酮類等,味甘、性平,主治醉酒、煩渴、嘔吐和二便不利;蒲公英可利尿、緩瀉、利膽;山藥改善脾虛泄瀉、久痢、虛勞咳嗽。葛根枳椇茶適用于熬夜傷肝、慢性肝病和解酒。目前針對兩種藥茶生物效應的研究甚少。斑馬魚與人類基因的同源性可以達到87%,具有發(fā)育周期短、身體透明和高通量等優(yōu)點,且在神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)與哺乳動物具有相似的發(fā)育機制與特點,其肝臟、腸道的結構和功能與哺乳動物也具有高度的相似性[13-14],利于進行基因編輯等分子操作得到突變體用于機制研究。筆者利用斑馬魚模型快速評價靈芝參芪茶和葛根枳椇茶生物效應,為這兩味藥茶的機制研究以及實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 斑 馬 魚

轉基因巨噬細胞綠色熒光Tg(mpeg1:EGFP)斑馬魚、野生型AB品系斑馬魚、黑色素等位基因突變半透明Albino品系斑馬魚、轉基因中性粒細胞綠色熒光Tg(mpx:EGFP)斑馬魚。以上實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2012-0171,實驗動物管理和使用委員會(IACUC)批準號為001458,國際AAALAC認證(001458),均來源于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司。實驗結束后按美國獸醫(yī)協(xié)會(American veterinary medical association,AVMA)條例對斑馬魚實施麻醉安樂死。

1.1.2 試 劑

酒石酸長春瑞濱注射液(批號140501,江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司);酒石酸長春瑞濱(批號C10946321,上海麥克林生化科技有限公司);破壁靈芝孢子粉膠囊(金日制藥有限公司);無水亞硫酸鈉(批號l1428128,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);六水合氯化鈷(批號WXBB8070V,Sigma-Aldrich,美國);中華跌打丸(批號191112,廣西梧州制藥股份有限公司);潑尼松(批號28778,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三硝基苯磺酸(TNBS,5%水溶液,批號WXBB8070V,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);RU21(批號25747,美國精神科學有限公司)。

1.1.3 儀 器

V3.11行為分析儀(Viewpoint life sciences,法國);電動聚焦連續(xù)變倍熒光AZ100顯微鏡(Nikon,日本);PCO-1500顯微注射儀(Zgenebio,中國臺灣);體視SZX7顯微鏡(Olympus,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥茶前處理方式

靈芝參芪茶和葛根枳椇茶,均為精細炮制后組合型沖泡即飲型藥茶包,由山西振東制藥股份有限公司提供,陰涼干燥儲存。臨用前采用料液比m(茶葉)∶m(水)=3∶600,95 ℃水沖泡2次,每次10 min(具體操作:稱量3 g藥茶于燒杯中,加入300 mL 95 ℃水沖泡10 min后,用0.45 μm濾膜過濾后收集上清備用;繼續(xù)向燒杯中加300 mL 95 ℃水沖泡10 min過濾后收集上清),合并兩次上清液作為5 mg/mL質量濃度母液,現(xiàn)配現(xiàn)用[15]。

1.2.2 增強免疫力(巨噬細胞數(shù)量、中性粒細胞數(shù)量)評價

將受精后2 d(2 dpf)Tg(mpeg1:EGFP)斑馬魚任意分配于6孔板中,每孔(即每實驗組)30尾。分別水溶給予靈芝參芪茶質量濃度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,陽性對照組質量濃度為350 μg/mL的破壁靈芝孢子粉膠囊,同時設置模型對照組、正常對照組,每孔定容3 mL。平行設置兩次實驗。除正常對照組外,一批實驗各組均水溶給予質量濃度400 μg/mL的酒石酸長春瑞濱誘導建立巨噬細胞減少癥模型[16-17];另一批各組均靜脈注射2 ng每尾(母液質量濃度0.2 mg/mL,每尾10 nL)酒石春瑞濱建立中性粒細胞減少癥模型[18]。酒石酸長春瑞濱與靈芝參芪茶共同處理24 h后實驗結束:1)根據(jù)死亡率確定靈芝參芪茶最大檢測質量濃度(The maximum tested concentration,MTC);2)取MTC及3個質量濃度組,分別為陽性對照組、正常對照組和模型對照組,每組任意吸取10尾置于熒光顯微鏡下拍照、保存圖片;3)用高級圖像NIS D 3.10處理軟件分析并采集每尾斑馬魚尾靜脈巨噬細胞熒光強度,用Image J分析并采集斑馬魚尾靜脈中性粒細胞數(shù)量。

1.2.3 抗疲勞和提高缺氧耐受力作用評價

取4 dpf AB斑馬魚,6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予靈芝參芪茶質量濃度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,以質量濃度1 000 μg/mL的中華跌打丸為陽性藥,同時設置正常對照組和模型對照組。平行設置兩次實驗。各組處理24 h后,除正常對照組外,一批實驗各組均水溶給予8 mg/mL無水亞硫酸鈉1.5 h建立低氧/缺氧疲勞模型[19-20];另一批各組均水溶給與1 mg/mL六水合氯化鈷2.5 h建立耐缺氧模型[21],實驗結束。根據(jù)死亡率確定MTC;取MTC及3個質量濃度組,分別為陽性對照組、正常對照組和模型對照組,每組任意吸取10尾斑馬魚轉移至96孔板中,1尾每孔,200 μL每孔,利用行為學分析儀檢測每尾斑馬魚1 h總運動距離(無水亞硫酸鈉模型S1,六水合氯化鈷模型S2)。

1.2.4 酒精性脂肪肝保護作用評價

取5 dpf AL斑馬魚,6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予葛根枳椇茶質量濃度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,同時設置模型對照組和正常對照組。除正常對照組外,各組均用1.5%乙醇建立斑馬魚酒精性脂肪肝模型[22]。乙醇與葛根枳椇茶共同處理30 h后實驗結束,在實驗終點根據(jù)死亡率確定MTC。取MTC及3個質量濃度組,分別為正常對照組和模型對照組斑馬魚,立即用4%多聚甲醛固定,經(jīng)PBS-丙二醇梯度脫水后,利用油紅O對肝臟甘油三酯進行染色,染色后每組任意吸取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照,用NIS D 3.10處理軟件分析并采集每尾斑馬魚肝臟脂肪染色強度。

1.2.5 解酒作用評價

取5 dpf AB斑馬魚,6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予葛根枳椇茶質量濃度625,1 250,2 500 μg/mL,陽性對照組RU21(RU-21安體普天然植物提取物復合片)質量濃度100 μg/mL,同時設置正常對照組和模型對照組。葛根枳椇茶處理24 h后,每組任意吸取12尾斑馬魚轉移至96孔板中,1尾每孔,200 μL每孔,除正常對照組外,其余各組均給予1.5%乙醇建立興奮期醉酒模型[23],立即用行為學分析儀檢測每尾斑馬魚1 h內總運動距離。

1.2.6 葛根枳椇茶胃腸道炎癥保護作用評價

取3 dpf Tg(mpx:EGFP)斑馬魚,6孔板/30尾/3 mL體系,分別水溶給予葛根枳椇茶質量濃度625,1 250,2 500 μg/mL,用質量濃度15 μg/mL的潑尼松作為陽性對照,同時設置正常對照組和模型對照組。各組處理48 h后,除正常對照組外,其余組別均水溶給予0.125% TBNS建立胃腸道炎癥模型[24]。葛根枳椇茶與TBNS繼續(xù)共同處理48 h后實驗結束。在實驗終點,每組隨機選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照,用NIS-Elements D 3.10軟件分析并采集每尾斑馬魚胃腸道中性粒細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學分析

用軟件GraphPad Prim5.0進行分析和統(tǒng)計,統(tǒng)計結果用mean±SE表示;計量資料用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統(tǒng)計學處理,以P<0.05作為差異具有顯著性的判斷標準。

2 實驗結果及分析

2.1 增強免疫力評價

2.1.1 確定MTC

在實驗終點,當靈芝參芪茶質量濃度為78.1～2 500 μg/mL時,斑馬魚未見明顯異常;當質量濃度為5 000 μg/mL時,誘發(fā)16.7%(5/30)斑馬魚死亡。提示靈芝參芪茶對免疫低下模型斑馬魚的MTC為2 500 μg/mL。

2.1.2 對巨噬細胞數(shù)量、中性粒細胞數(shù)量的影響

徐麗華[25]采用小鼠碳粒廓清實驗證實,靈芝飲料濃縮液可顯著升高免疫功能低下小鼠吞噬指數(shù);任娟等[26]通過大鼠碳粒廓清和小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應也發(fā)現(xiàn),黨參黃芪聯(lián)合提取的多糖具有增強小鼠特異性和非特異性免疫功能、提高大鼠免疫力作用。

斑馬魚尾靜脈巨噬細胞熒光強度、中性粒細胞數(shù)量如表1所示。由表1可知:模型斑馬魚尾部靜脈巨噬細胞熒光強度顯著降低,與正常斑馬魚比較P<0.001,提示免疫低下模型構建成功。當陽性對照破壁靈芝孢子粉膠囊質量濃度為350 μg/mL和靈芝參芪茶質量濃度為625,1 250,2 500 μg/mL時,巨噬細胞熒光強度均顯著增強,與模型對照組比較均為P<0.001,提示靈芝參芪茶可通過增加巨噬細胞數(shù)量從而表現(xiàn)出增強免疫力作用。

表1 斑馬魚尾靜脈巨噬細胞熒光強度、中性粒細胞數(shù)量(n=10)

斑馬魚尾靜脈中性粒細胞數(shù)量典型圖如圖1所示。圖1中熒光顆粒為中性粒細胞,虛線框內為分析區(qū)域。

圖1 斑馬魚尾靜脈中性粒細胞數(shù)量典型圖

由表1和圖1可知:模型斑馬魚尾部靜脈中性粒細胞數(shù)量顯著減少,與正常斑馬魚比較比較P<0.001,提示免疫低下模型構建成功。破壁靈芝孢子粉膠囊350 μg/mL和靈芝參芪茶625,1 250,2 500 μg/mL質量濃度組中性粒細胞數(shù)量均顯著增加,幾乎恢復到正常水平,與模型對照組比較均P<0.001。因此,提示靈芝參芪茶可通過增加中性粒細胞數(shù)量從而表現(xiàn)出增強免疫力作用。

2.2 抗疲勞和提高缺氧耐受力作用評價

2.2.1 MTC

在實驗終點,當靈芝參芪茶質量濃度為78.1～5 000 μg/mL時,斑馬魚均未見明顯異常,提示靈芝參芪茶對疲勞模型斑馬魚的MTC為5 000 μg/mL。

2.2.2 抗低氧/缺氧疲勞、提高缺氧耐受力

Xu等[27]、劉曉薇等[28]和Feng等[29]采用小鼠負重游泳、常壓缺氧、缺氧瓶急性缺氧實驗證實,靈芝茶、靈芝飲料濃縮液具有明顯延長負重游泳時間、延長缺氧狀態(tài)下小鼠生存時間和增加耗氧率作用。實驗利用無水亞硫酸鈉消耗水中的氧氣模擬建立低氧/缺氧環(huán)境,從而誘導斑馬魚出現(xiàn)低氧疲勞的運動狀態(tài),表現(xiàn)為總運動距離(S1)顯著減少。另外利用氯化鈷中的鈷離子(Co2+)可通過取代氧感受器血紅素蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子(Fe2+),使血紅素蛋白不能與氧結合的機制,利用從氯化鈷建立缺氧耐受模型,模型斑馬魚也表現(xiàn)出總運動距離(S2)顯著減少的行為。在這2個模型上,用靈芝參芪茶進行干預,無水亞硫酸鈉誘導低氧/缺氧實驗每尾斑馬魚總運動距離軌跡如圖2所示,其中每個圓圈代表1尾斑馬魚1 h累積運動軌跡。

斑馬魚總運動距離如表2所示。由表2可以看出:靈芝參芪茶不僅可以改善低氧/缺氧疲勞斑馬魚的行為,而且可以提高缺氧耐受力,增加斑馬魚總運動距離。與哺乳動物結果相一致。

表2 斑馬魚總運動距離(n=10)

2.3 對酒精性脂肪肝預防作用評價

2.3.1 MTC

在實驗終點,當葛根枳椇茶質量濃度為78.1～2 500 μg/mL時,斑馬魚均未見明顯異常;當質量濃度為5 000 μg/mL時,誘發(fā)100%(30/30)斑馬魚死亡。提示葛根枳椇茶對酒精性脂肪肝模型斑馬魚的MTC為2 500 μg/mL。

2.3.2 酒精性脂肪肝預防作用評價

葛根解酒護肝作用在國際上已經(jīng)取得了廣泛認可,并有大量哺乳動物實驗佐證[30-32]。枳椇子水提物可通過降低乙醇引起的血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST),改善肝臟脂肪變性及炎癥而預防酒精性脂肪肝[33-35]?，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究證明,葛根與枳椇子之間沒有配伍禁忌,都屬于藥食同源類,聯(lián)合使用具有解酒護肝[23]和清濕熱的功效[36]。

斑馬魚肝臟脂肪染色結果典型圖以及肝臟脂肪染色強度分別如圖3和表3所示。圖3中虛線框內為分析區(qū)域,即斑馬魚肝臟。由圖3和表3可知:模型斑馬魚肝臟甘油三酯經(jīng)油紅O染色后呈現(xiàn)出深紅色,而正常斑馬魚肝臟呈無色(或僅背景色),表明酒精誘發(fā)斑馬魚脂肪肝模型建立成功。葛根枳椇茶干預后,僅625 μg/mL質量濃度具有明顯預防酒精性脂肪肝作用,與模型對照組比較P<0.001。

圖3 斑馬魚肝臟脂肪染色強度典型圖

表3 斑馬魚肝臟脂肪染色強度(n=10)

2.4 解酒作用評價

RU21經(jīng)美國藥品監(jiān)督管理局(Food and drug administration,FDA)鑒定和俄羅斯科學院臨床試驗結果證實,具有減緩乙醇氧化,加速毒性物質分解成乙酸、二氧化碳和水的作用,是公認解酒劑。

葛根枳椇茶處理后,各濃度組斑馬魚總運動距離如表4所示。由表4可知:給予1.5%乙醇后,斑馬魚立刻進入興奮期醉酒狀態(tài),對每尾斑馬魚運動軌跡進行捕捉和分析,可見與正常對照組比較,模型對照組總運動距離顯著增加(P<0.001),提示模型建立成功。RU21可顯著降低模型斑馬魚總運動距離(P<0.01)。對葛根枳椇茶質量濃度分別為625,1 250,2 500 μg/mL干預后,總運動距離顯著降低,逐漸恢復至正常水平,且具有劑量依賴性,提示葛根枳椇茶具有解酒功效。這與哺乳動物結果相一致,有研究表明:葛根異黃酮可通過提高肝臟乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性,清除乙醇及代謝產(chǎn)物[37-39]。

表4 葛根枳椇茶處理后斑馬魚總運動距離(n=12)

2.5 腸道炎癥預防作用評價

葛根和枳椇子在抗炎方面臨床應用也比較成熟,如葛根提取物通過下調p38/MAPK、NF-κB/p65和上調PPARγ蛋白表達而改善潰瘍性結腸炎(UC)模型大鼠一般狀況及黏膜保護作用[34];葛根芩連湯在治療病毒性腸炎的應用也頗為廣泛[40-41]。

斑馬魚胃腸道中性粒細胞數(shù)目典型圖及統(tǒng)計結果分別如圖4和表5所示。圖4中:熒光顆粒為中性粒細胞,虛線框內為分析區(qū)域。由圖4和表5可知:模型斑馬魚腸道中性粒細胞數(shù)量明顯升高,與正常斑馬魚比較P<0.001,提示腸炎模型構建成功。當陽性對照潑尼松質量濃度為15 μg/mL和葛根枳椇茶質量濃度為625,1 250,2 500 μg/mL時,腸道中性粒細胞數(shù)量均明顯減少,恢復至正常水平。因此,提示葛根枳椇茶可通過降低中性粒細胞數(shù)量從而表現(xiàn)出預防腸道炎癥作用。

圖4 斑馬魚胃腸道中性粒細胞數(shù)目典型圖

表5 斑馬魚胃腸道中性粒細胞數(shù)目(n=10)

3 結 論

首先,利用可視化的轉基因巨噬細胞(Tg(mpeg1:EGFP))、中性粒細胞(Tg(mpx:EGFP))發(fā)熒光斑馬魚,結合可量化的統(tǒng)計分析方法,快速、直觀和科學地評價了靈芝參芪茶增強免疫力作用;然后,利用行為分析儀對每尾斑馬魚的運動軌跡進行高通量(96孔)追蹤,評價了在無水亞硫酸鈉、氯化鈷兩種誘導劑誘導的低氧/缺氧模型下靈芝參芪茶抗疲勞和提高缺氧耐受能力;最后,利用油紅O染色法對肝臟甘油三酯進行染色,將肝臟表型結合圖片數(shù)據(jù)采集分析評價葛根枳椇茶對酒精性脂肪肝的預防作用,并評價了葛根枳椇茶對興奮期醉酒模型斑馬魚行為學的改善作用和對TNBS誘導的胃腸道炎癥預防功效。實驗結果表明:靈芝參芪茶不僅可通過增加巨噬細胞數(shù)量和中性粒細胞數(shù)量從而表現(xiàn)出增強免疫力作用,而且可通過改善不同作用機制導致的低氧/缺氧疲勞斑馬魚的行為,增加運動能力,提高缺氧耐受力;葛根枳椇茶不僅可通過降低肝臟甘油三酯含量起到具有酒精性脂肪肝作用,顯著降低興奮期醉酒模型斑馬魚的行為,而且可通過降低中性粒細胞數(shù)量從而表現(xiàn)出預防胃腸道炎癥功效。研究為靈芝參芪茶和葛根枳椇茶的生物效應及理論研究提供了依據(jù)。