謝博歡，李雁，常艷賓，林騰龍，李琳琳

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150036

穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）又可稱勞力性心絞痛，是慢性冠狀動脈綜合征 （chronic coronary syndrome，CCS）中的較為常見的疾病。隨著SAP 患病率以及病死率的逐年升高，近年來SAP被WTO 認(rèn)為是心血管疾病中最常見的威脅人類健康的主要死因[1]。臨床常用藥為：β 受體拮抗劑、ACEI/ARB 類、硝酸酯制劑、抗血小板藥、鈣通道阻滯劑、降脂藥等藥物，雖然治療效果不錯，但是服用這些藥物有可能會出現(xiàn)某些不良反應(yīng)導(dǎo)致患者停藥，又或長期服用會導(dǎo)致機體產(chǎn)生耐藥性，此外還有患者依從性差等其他原因，進而會影響整體的治療效果。而在祖國醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，隨著對SAP 認(rèn)識的逐漸加深，中醫(yī)藥不僅具備療效好、安全性高、不良反應(yīng)發(fā)生率低這些優(yōu)點，而且還同時具有延緩病情發(fā)展、降低疾病復(fù)發(fā)率、改善預(yù)后等其他方面的獨特優(yōu)勢，擁有非常廣闊的研究前景。

陳皮、半夏作為臨床常用藥，兩者常相須為用，而且通常作為治療心血管疾病的核心藥對被廣泛使用，用來治療較為常見的痰濁阻滯型SAP[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建藥物的“活性成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，是建立在生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)等多個學(xué)科的技術(shù)和知識的基礎(chǔ)之上，可以幫助我們更加得清楚藥認(rèn)識藥物疾病之間的關(guān)系，了解藥物作用于疾病的機制，是一種可以全面、系統(tǒng)得進行科學(xué)研究的方法，為中醫(yī)藥的進一步研究提供了新方法、新角度，為廣大學(xué)者所喜愛。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，研究藥對“陳皮-半夏”治療SAP 的作用機制，從而為其治療SAP 的藥理學(xué)研究及臨床應(yīng)用提供進一步參考。

資料與方法

1 “陳皮-半夏”中活性成分的篩選和靶點預(yù)測

在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）網(wǎng)絡(luò)平臺分別以陳皮、半夏作為關(guān)鍵詞檢索、獲取其活性成分，并篩選活性成分，篩選的條件設(shè)置為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，篩選得到活性成分后選擇“R elated Targeted”，進一步檢索篩選出來的活性成分，得到藥物活性成分的相關(guān)靶點，再利用Uniport（https：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一整合成Gene ID。

2 構(gòu)建“陳皮-半夏”“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

將陳皮、半夏得活性成分以及靶點導(dǎo)入CytoScape 3.8.0 構(gòu)建出網(wǎng)絡(luò)圖，在構(gòu)建出的網(wǎng)絡(luò)中藥物活性成分、活性成分的靶點基因用“節(jié)點”（node）表示，二者之間的關(guān)系用“邊”（edge）表示；使用CytoScape 內(nèi)置的Network Analyzer 工具分析這個網(wǎng)絡(luò)圖特征，包括網(wǎng)絡(luò)連接度（degree）、介度（betweenness）和緊密度（closeness）等數(shù)據(jù)，以此研究藥物的活性成分與靶點基因及兩者之間的關(guān)系。

3 穩(wěn)定型心絞痛相關(guān)靶點檢索

將“stable angina pectoris”作為關(guān)鍵詞，在Gene cards（https：//www.genecards.org）、Drug bank（https：//go.drugbank.com/）、OMIM（http：//www.omim.org）、OMIM-Gene Map（http：//wwwomim.org/search/advanced/geneMap）等疾病基因數(shù)據(jù)庫檢索、篩選，整理得出的結(jié)果，之后在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中將結(jié)果進行統(tǒng)一規(guī)范，并借助VENNY2.1 獲得藥物與疾病的交集靶點基因（靶點蛋白）。

4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及模塊構(gòu)建

使用String（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將“陳皮-半夏”與SAP 的交集靶點分別導(dǎo)入String 內(nèi)，生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出結(jié)果，利用CytoScape3.8.0，繪制高級PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。運用CytoScape 中的MCODE 插件，通過分子復(fù)合物檢測算法對相互作用關(guān)系進行分析，構(gòu)建不同功能模塊。

5 通路富集分析

將交集靶點導(dǎo)入Metascape 網(wǎng)絡(luò)平臺（https：//metascape.org） 進 行GO-BP（biological process）、GO-CC（cellular component）、GO-MF（molecular function）KEGG 分析，保存分析結(jié)果并通過微生信網(wǎng)站進行可視化。

6 “藥物成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

借助CytoScape3.8.0 來構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中“節(jié)點”代表活性成分、通路，“邊”代表二者之間的作用關(guān)系；使用CytoScape 中的Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)特征，包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（closeness）等，以研究活性成分、通路及靶點基因及其相互之間的關(guān)系。

結(jié) 果

1 “陳皮-半夏”活性成分、靶點的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫初步獲取成分陳皮63 個，半夏116 個，通過OB 和DL 參數(shù)篩選后，獲得活性成分陳皮5 個，半夏13 個，共18 個見表1。選擇Related Targets 預(yù)測陳皮、半夏篩選出的活性成分的靶點，并利用Uniport 轉(zhuǎn)換成gene ID，獲得陳皮活性成分靶點基因66 個，半夏活性成分的靶點基因136，共獲得202 個靶點基因。

表1 “陳皮-半夏”活性成分

2 “陳皮-半夏”活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將陳皮、半夏的活性成分以及其相應(yīng)的靶點基因?qū)隒ytoScape3.8.0 繪制其關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖并分析，共獲得106 個節(jié)點與219 條關(guān)系，結(jié)果見圖1（節(jié)點表示活性成分、靶點基因，連線表示作用關(guān)系，節(jié)點大小、節(jié)點顏色深淺和節(jié)點透明度均按degree 值從大到小依次排列，即degree 值越大，節(jié)點越大、顏色越深，透明度越高）。

圖1 “陳皮-半夏”活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

3 SAP 相關(guān)靶點檢索檢索

利用Gene cards、Drug bank 、OMIM、OMIM-Gene Map 等疾病數(shù)據(jù)庫搜索“stable angina pectoris”，得到的靶點個數(shù)分別為854、119、101、8，篩選并去除重復(fù)值后得到靶點1016 個。利用VENNY2.1 繪制韋恩圖可得出藥物靶點與疾病靶點交集為48 個，見圖2（list1為疾病靶點基因，list2 為藥物靶點基因）。

圖2 韋恩圖

4 “陳皮-半夏”治療SAP 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

4.1 “陳皮-半夏”治療SAP 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖繪制 運用String 構(gòu)建“陳皮-半夏”與SAP 共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，將交集靶點基因提交至String 網(wǎng)絡(luò)平臺，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，剔除掉游離基因后如圖3A，保存結(jié)果將其導(dǎo)入CytoScape3.8.0，繪制高級PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3B。

圖3 A PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 B CytoScape 美化后的PPI

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖之所以是無向圖，是因為網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)是相互作用的。community 或module 是PPI 中隱藏的子網(wǎng)，是網(wǎng)絡(luò)中密度較高的區(qū)域，是具有生物學(xué)意義的合集，可表示蛋白質(zhì)復(fù)合體（protein complex）或者功能模塊（functional module）[3]。故為更精確地分析“陳皮-半夏”治療SAP 的作用機制，在構(gòu)建出PPI 網(wǎng)絡(luò)后運用CytoScape3.8.0 中的MCODE 工具，通過其特有算法對活性成分與靶點得相互作用關(guān)系進行分析，構(gòu)建出module1、module2、module3 三個功能模塊，見圖4A、4B、4C。根據(jù)P 值，分別保留Module中3 個最佳評分的生物學(xué)進程對其進行功能描述，見表2。

圖4 A Module1

圖4 B Module2

圖4 C Module3

表2 Module1、2、3 最佳生物進程

5 “陳皮-半夏”治療SAP 通路富集分析可視化

將48 個交集基因?qū)隡etascape 網(wǎng)絡(luò)平臺進行富集分析，分別進行KEGG 以及GO 的BP、CC、MF 富集分析，保存結(jié)果，并運用微生信網(wǎng)站將結(jié)果中Log10（P）值排名為前20 的繪制氣泡圖進行可視化，KEGG的可視化結(jié)果見圖5，GO-BP、CC、MF 的可視化結(jié)果見圖6（氣泡面積大小代表通路中的基因數(shù)多少，氣泡的顏色由綠到紅代表-Log10（P）值從小到大，橫軸代表P 值，豎軸代表通路名稱）

圖5 KEGG 富集分析

圖6 GO 富集分析-BC、CC、MF

6 “藥物成分-SAP 靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及關(guān)鍵成分及靶點基因篩選

排除與本病無關(guān)的通路后，使用CytoScape 軟件制作“藥物成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7（藥物成分用菱形表示，通路用倒三角表示，疾病靶點用圓形表示，作用關(guān)系用連線表示，degree 值大小用節(jié)點面積大小代表）。并通過CytoScape 內(nèi)置的Network Analyzer 分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，分析表明，β-谷甾 醇（Degree）為32，介 度（Betweenness Centrality）為0.2557，緊密度（Closeness Centrality）為0.4474，預(yù)測β-谷甾醇為“陳皮-半夏”藥對治療SAP 的關(guān)鍵成分，其次為Cavidine（連接度為27，介度為0.1861，緊密度為0.4182）、川陳皮素（連接度為25，介度為0.2090，緊密度為0.4212），見表3。PTGS2 在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為14，介度為0.1441，緊密度為0.4978，預(yù)測PTGS2 為“陳皮-半夏”藥對治療SAP 的最主要靶點。HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 亦為相對重要的靶點。

圖7 “藥物成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 “陳皮-半夏”治療SAP 的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

討 論

穩(wěn)定型心絞痛（SAP）在祖國醫(yī)學(xué)中學(xué)中歸為“胸痹”“心痛”病的范疇，引起疾病發(fā)生的內(nèi)外因素包括：情志失調(diào)、飲食不節(jié)、勞倦內(nèi)傷、寒邪內(nèi)侵、體虛等，其病位在心、肝、腎、脾等臟腑，主要在心，基本病機為“陽微陰弦”，為本虛標(biāo)實之證，本虛為氣、血、陰、陽虧虛以致心脈失養(yǎng)；標(biāo)實為寒凝、血瘀、氣滯、痰濁導(dǎo)致胸陽不展、心脈不通[4]。由于現(xiàn)在人們飲食上膏粱厚味，導(dǎo)致痰濁內(nèi)生，阻滯氣機，所以臨床中痰濁阻滯型SAP 較為常見，“陳皮-半夏”在臨床中是常用的理氣祛痰藥對，陳皮味苦、辛，性溫，燥濕化痰、理氣開胸，半夏味辛，性溫，溫化寒痰，尤善治臟腑之痰，兩者相須為用，可理氣化痰，通痹止痛[5]，有效治療“痰濁阻滯型”SAP。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步篩查“陳皮-半夏”的主要活性成分為naringenin（柚皮素）、nobiletin（川陳 皮 素）、coniferin（松 柏 苷）、baicalein（黃 芩 素）、beta-sitosterol（β- 谷 甾 醇）、Baicalin（黃 芩 苷）、Stigmasterol（豆甾醇）等18 個活性成分，篩選出與SAP 相 關(guān) 的 靶 點 基 因MAPK3、TP53、HSP90AA1、PPARG、JUN 等48 個。PPI 可 分 解 出 三 個 功 能 模塊，三個模塊中最佳評分的生物學(xué)進程為：Cellular response to chemical stress、Positive regulation of heart rate by epinephrine-norepinephrine、Blood coagulation，fibrin clot formation。GO 富集分析集中作用于regulation of tube diameter（管徑調(diào)節(jié)）、blood vessel diameter maintenance（血 管 直 徑 維 持）、regulation of tube size（管 尺 寸 調(diào) 節(jié)）、regulation of muscle contraction（調(diào) 節(jié) 肌 肉 收 縮）、regulation of blood pressure（調(diào)節(jié)血壓）、regulation of blood circulation（調(diào)節(jié)血液循環(huán)）、adenylate cyclase-modulating G proteincoupled receptor signaling pathway（腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路）、regulation of muscle system process（肌肉系統(tǒng)過程）、vascular process in circulatory system（循環(huán)系統(tǒng)中的血管進程）、blood circulation（血液循環(huán)）等相關(guān)生物過程（biological process），KEGG 功能富集集中于Adrenergic signaling in cardiomyocytes（心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號）、Calcium signaling pathway（鈣信號通路）、Lipid and atherosclerosis（脂質(zhì)和動脈粥樣硬化）、cAMP signaling pathway（cAMP 信號通路）、Apoptosis（細(xì)胞凋亡）等信號通路。這證明“陳皮-半夏”治療“痰濁阻滯型”SAP 具有多成分、多靶點、多通路聯(lián)合生效的優(yōu)點。

將“藥 物 成 分-SAP 靶 點- 通 路”網(wǎng) 絡(luò) 用CytoScape 內(nèi)置的Network Analyzer 分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)可以得出：β-谷甾醇、Cavidine、川陳皮素為“陳皮- 半夏”治療SAP 的關(guān)鍵活性成分；PTGS2、HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 為為“陳皮-半夏”治療SAP 的關(guān)鍵靶點基因。

有實驗[6]發(fā)現(xiàn)，Nob（川陳皮素）可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，減輕氧化應(yīng)激損傷。也有實驗[7]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可防止中風(fēng)、靜脈血栓等危險事件的發(fā)生，是β-谷甾醇經(jīng)過非競爭性抑制凝血酶的活性從而發(fā)揮抗凝作用，使血栓溶解。此外還有實驗[8]得出，β-谷甾醇對哇巴因、烏頭堿以及心肌缺血引起的心率失常有明顯遏制作用。因此“陳皮-半夏”可能通過川陳皮素、β-谷甾醇治療SAP。

有研究[9]報道，COX-2（PTGS2）靶點蛋白在炎癥和動脈血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，血小板聚集和局部炎癥反應(yīng)都是加快血栓形成的重要因素，下調(diào)COX-2 的表達能夠改善可能引起血栓的細(xì)胞炎性因子變化，降低細(xì)胞炎性反應(yīng)，有可能減緩冠心病動脈血栓形成。在急性心梗和冠心病患者中血清COX-2水平升高，在大鼠頸動脈血栓形成模型中COX-2 的表達在誘導(dǎo)血栓形成后14 天顯著升高，而下調(diào)COX-2后能顯著改善大鼠的癥狀[10]。

李琳、蔡紅雁、郭濤[11]等做實驗證明，心功能異常、心肌肥大和心臟重塑可由β 腎上腺素能受體信號（βA R）的長期激活引起。王彥珍、羅健東[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)外界刺激或體液因子導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高時，通過Ca2＋／CaM 激活鈣信號通路（CaN），活化的CaN 發(fā)生細(xì)胞質(zhì)中的NF-AT3 去磷酸化進入細(xì)胞核等一系列反應(yīng)，結(jié)果使心肌收縮蛋白基因表達上調(diào)、蛋白合成增加、細(xì)胞體積增大，心肌從而發(fā)生肥大。過表達circUK2 可通過靶向下調(diào)miR-483-5p 抑制oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，從而減少心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13]。因此推測“陳皮-半夏”治療SAP 主要是通過β-谷甾醇、川陳皮素作用于PTGS2（COX-2）靶點蛋白刺激心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號、鈣信號通路、細(xì)胞凋亡等信號通路來治療SAP。

結(jié)合上述討論可以看出，“陳皮-半夏”這一藥對的同一活性成分可作用于不同靶點，而同一靶點又可調(diào)控不同生物學(xué)過程和信號通路，顯現(xiàn)出“陳皮-半夏”治療SAP 擁有多通路、多靶點聯(lián)合作用的優(yōu)點。這表明如果調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的單個或多個重要靶點即可對整個網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)，這為臨床上使用“陳皮-半夏”治療“痰濁阻滯”型SAP 提供了科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)審定“陳皮-半夏”臨床療效指標(biāo)提供了標(biāo)準(zhǔn)，也為發(fā)掘“陳皮-半夏”的潛在作用機制提供了新的方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運用網(wǎng)絡(luò)科學(xué)的方法來研究中藥多方面的藥理特性，用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)來反饋中藥有效成分的各項理化和生物學(xué)性質(zhì)，為探索單味中藥、中藥藥對、中藥方劑的各種復(fù)雜作用模式提供了新的角度[14]，同時也為其在臨床中的應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但由于只是推論，所以仍舊需要實驗來加以驗證，進而明確“陳皮-半夏”治療SAP 的主要調(diào)控靶點。