趙芬芬，施衛(wèi)兵，齊春偉，許文彬，馬翠翠，郭錦晨

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230031

3 新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 安徽合肥 230038

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由HBV 病毒持續(xù)性感染而發(fā)生的慢性肝臟炎性損害病變，會發(fā)生不同程度的肝損傷，最終發(fā)展為肝硬化、肝癌等，威脅人類生命健康。目前臨床上尚無能完全治愈CHB 的特效藥[1]，所以抗病毒仍是治療CHB 的主要方法[2]，但存在耐藥風(fēng)險、不良反應(yīng)等相關(guān)問題，影響療效，遠期預(yù)后不佳[3]。

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認為CHB 是由濕熱之邪侵入人體，人體正氣不足無力抗邪而起，常將CHB 歸于中醫(yī)學(xué)的“脅痛”“黃疸”等中醫(yī)疾病范疇。赤茵合劑為安徽省中醫(yī)院的自擬方，曾用名赤茵糖漿，臨床應(yīng)用近30 年，療效確切。曹承樓等人[4]的研究發(fā)現(xiàn)，赤茵合劑對黃疸型病毒性肝炎肝膽濕熱型有明顯的治療作用。研究表明，赤茵合劑可有效降低肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸患者血清 ALT、GGT、ALP 的水平，降低肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸患者的血清LN、C-IV 水平，對改善肝組織纖維化也有良好的效果[5]。楊小軍、施衛(wèi)兵、胡大慶等[6-8]人的研究證實了赤茵合劑對慢性乙型黃疸性肝炎、慢性乙型肝炎高膽紅素血癥及淤膽型乙型肝炎均有良好的治療效果。然而，赤茵合劑治療CHB 的作用機制尚未完全明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，分析赤茵合劑治療CHB 的有效成分、作用靶點及信號通路，探究赤茵合劑治療CHB 的潛在作用機制，為臨床應(yīng)用赤茵合劑治療CHB 提供理論支持。

資料與方法

1 篩選赤茵合劑有效成分及靶點

高口服生物利用度是確定生物分子作為治療劑的藥物樣特性的關(guān)鍵性指標(biāo)，借助中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/），設(shè)置篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥40%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，獲取赤茵合劑藥物活性成分和相對應(yīng)的靶點，同時采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點名稱。

2 篩選CHB 靶點

進 入GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/），將“Chronic hepatitis B”作為關(guān)鍵詞進行檢索，以得分＞中位數(shù)13.60 為標(biāo)準(zhǔn)篩選，通過OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.Drugbank.com/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）及PharmGkb 數(shù)據(jù)庫，將“Chronic hepatitis B”作為關(guān)鍵詞，進行檢索，得到各數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的CHB 靶點，將五個數(shù)據(jù)庫的靶點合并后去重即為CHB 的靶點。將藥物與疾病靶點對比分析，獲得赤茵合劑治療CHB的潛在靶點。

3 構(gòu)建分析“赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-CHB”網(wǎng)絡(luò)

建立潛在靶點、有效成分相關(guān)文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建“赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-慢性乙型肝炎”網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行相關(guān)分析。

4 構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（PPI），篩選核心靶點

借 助STRING 在 線 數(shù) 據(jù) 庫（https：//stringdb.org/），導(dǎo)入潛在靶點，限定研究物種為“Homo sapiens”，進行蛋白質(zhì)互作分析，置信度設(shè)為≥0.400，隱藏游離節(jié)點，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，保存為TSV 文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，優(yōu)化相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，利用MCODE 插件進行聚類，并分析篩選出核心靶點。

5 GO 功能富集和KEGG 通路分析

將“1.2”中的潛在靶點上傳至Matescape 數(shù)據(jù)庫（https：//Matescape.ncifcrf.gov/），以“Homo sapiens”為限定條件，進行GO 功能富集和KEGG 通路分析。其中GO 重點了解靶點主要的作用過程，而KEGG 主要了解細胞的生化過程，最后使用微生信將結(jié)果可視化。

6 分子對接驗證

將核心靶點作為分子對接的受體，在PDB 數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)的pdb 格式，運用pymol 軟件進行去除水分子和原有配體，得到相應(yīng)的受體結(jié)構(gòu)；Pubchem 中下載的活性成分的3D 結(jié)構(gòu)作為小分子配體。然后準(zhǔn)備PDBQT 文件，根據(jù)靶點口袋調(diào)整 Gridbox 坐標(biāo)及大小，采用AutoDock Vina 進行分子對接，借助PyMol、LigPlot+軟件進行可視化處理。

結(jié) 果

1 赤茵合劑有效成分及靶點與CHB 靶點收集

通過“1”中的條件在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索，收集到有效成分：赤芍17 個，茵陳10 個，丹參43 個，苦參38 個，大黃11 個，葛根3 個，甘草69 個。去除重復(fù)成分、剔除無法預(yù)測相關(guān)靶點的化合物，最終確定赤茵合劑有效成分150 個，將每味中藥位于前5 的化合物列出（表1）。通過查閱文獻可知芍藥內(nèi)酯苷為赤芍的主要成分，木犀草素為茵陳的主要成分，故將此2 種化合物納入，通過Pubchem、SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫篩選相關(guān)靶點，運用Uniport 數(shù)據(jù)庫校正靶點，去除重復(fù)基因并刪除非人源性靶點。最終得到152 個有效成分，351 個靶點。

表1 赤茵合劑有效活性成分基本信息

進入GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫及PharmGkb 數(shù)據(jù)庫，將“chronic hepatitis B”作為關(guān)鍵詞，進行檢索，將五個數(shù)據(jù)庫的靶點合并去重后獲得1113 個與CHB 相關(guān)的靶點。

將赤茵合劑有效成分對應(yīng)的351 個藥物靶點與CHB 對應(yīng)的1113 個疾病靶點進行對比分析后獲得127 個共有靶點，即為赤茵合劑作用于CHB 發(fā)揮治療作用的潛在靶點（圖1），其中槲皮素（Quercetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、丹參酮IIA（Tanshinone IIA）、芒柄花黃素（Formononetin）Degree 值排名靠前（圖2），認為可能是發(fā)揮作用的主要成分。

圖1 藥物-疾病共同靶點

圖2 化合物Degree 值

2 “ 赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-CHB”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

建立潛在靶點、有效成分與中藥、疾病的相關(guān)文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，構(gòu)建“中藥-有效成分-潛在靶點-CHB”可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

圖3 “赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-CHB”網(wǎng)絡(luò)圖

3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將127 個潛在靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)出TSV 格式文件，再將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，利用“Network Analyzer”進行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。CytoHubba 可以準(zhǔn)確地篩選出網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，其中最大集團中心度（maximal cliquecentrality，MCC）算法被證實是預(yù)測重要靶點較為精確的方法之一。通過MCC 算法，確定的關(guān)鍵靶點即為赤茵合劑治療CHB 的核心靶點（圖5），并根據(jù)degree 值繪制條形圖（圖6），再運用Cytoscape3.7.2中的MCODE 插件，對交集靶點進行聚類功能模塊分析，共得到6 個功能模塊（圖7A-圖7F），并對其進行打分（圖8），模塊1-3 的MCODE 聚類得分分別為53.5 分、6 分和3.333 分。第一類由65 個靶點組成，是MCODE 集群得分最高的功能模塊，該模塊的靶基因主要富集在病毒感染、免疫、和癌癥相關(guān)的通路中；第2 類包含23 個靶點，涉及蛋白質(zhì)磷酸化、激酶活性的調(diào)節(jié)、有絲分裂細胞周期相變、凋亡信號通路的調(diào)控等生物過程；第3 類包含4 個靶點，與外源代謝和分解過程、雌激素代謝過程、不飽和脂肪酸代謝過程相關(guān)。

圖4 PPI

圖5 核心靶點

圖6 核心靶點Degree 值

圖7 交集靶點功能模塊圖

圖8 模塊評分

4 GO 功能富集分析

利用PANTHER 在線平臺，對127 個潛在靶點進行分類（圖9），主要包括蛋白質(zhì)修飾酶、代謝物相互轉(zhuǎn)化酶、細胞間信號分子、跨膜信號受體、基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、蛋白質(zhì)結(jié)合活性調(diào)節(jié)劑等。運用Matescape 數(shù)據(jù)庫對127 個潛在靶點進行GO 功能富集分析，閾值P 設(shè)定為＜0.05，包括了466 條生物過程、55 條細胞組分、107 條分子功能。生物過程（biological process，BP）（圖10）分析可以看出這些靶點主要涉及對RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程等466 條生物過程。

圖9 潛在靶點分類

圖10 BP 分析結(jié)果（前20 條）

5 KEGG 通路富集分析

運用Matescape 數(shù)據(jù)庫進對127 個潛在靶點進行KEGG 通路富集分析，閾值P設(shè)定為＜0.05，得到169 條KEGG 富集結(jié)果，包括PI3K-Akt 信號通路、Hepatitis B 信號通路、MAPK 信號通路等通路等，列出相關(guān)富集結(jié)果的前20 位（表2）。繪制KEGG 靶點-通路圖（圖11），并對KEGG 通路進行分類（圖12），主要包括人類疾病、信息處理過程、細胞過程和組織系統(tǒng)，多與炎癥通路和病毒感染通路相關(guān)。

圖11 KEGG 靶點-通路圖

圖12 KEGG 通路分類圖

表2 KEGG 通路富集分析（前20 條）

6 分子對接分析

將1 中的主要成分包括槲皮素、毛蕊異黃酮、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、芒柄花黃素作為分子對接的配體，將存3 中的核心靶點作為受體，準(zhǔn)備相關(guān)文件，采用AutoDock Vina 進行分子對接，同時評定自由結(jié)合能（圖13-圖14）。若自由結(jié)合能＜0，表明配體和受體可以自發(fā)地結(jié)合，若自由結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol，則說明兩者結(jié)合較好，若結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol，則說明兩者結(jié)合較強[9]。本研究選取≤-7.0 kcal/mol的對接結(jié)果，使用PyMol、LigPlot+軟件，將結(jié)合能前6位的對接結(jié)果制作2D 對接示意圖（圖15）。由圖13可知，所有的自由結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，由圖14可見，自由結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol 占比63%，說明槲皮素、毛蕊異黃酮、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、芒柄花黃素與核心靶點均能自發(fā)結(jié)合，且有較好的結(jié)合活性，且大部分均具有較強的結(jié)合活性。

圖13 自由結(jié)合能評分

圖14 自由結(jié)合能比例圖

圖15 分子對接2D 模型圖

討 論

CHB 是世界醫(yī)學(xué)界公認的難題，具有傳染性，尚不能完全治愈，容易發(fā)展成肝硬化、肝癌。目前主要以抗病毒治療為主，但長期單一使用抗病毒藥物容易產(chǎn)生不良反應(yīng)。越來越多的臨床研究表明，中醫(yī)藥在改善慢乙肝患者臨床癥狀、保肝降酶、抗肝臟纖維化、調(diào)節(jié)免疫等方面具有獨特優(yōu)勢[10]。赤茵合劑由茵陳蒿湯化裁而來，其組成包括赤芍、茵陳、丹參、葛根、苦參、大黃、生甘草7 味中藥，其中赤芍、茵陳同入肝經(jīng)，共為君藥，清肝膽之濕，泄血分郁熱；丹參、葛根為臣藥，以宣暢氣機，通絡(luò)活血，佐以苦參、大黃，燥濕解毒，通腑散瘀；以甘草為使，淸熱解毒、調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏清熱利濕、解毒保肝之效。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法分析預(yù)測赤茵合劑治療CHB 的作用機制，通過篩選共預(yù)測出赤茵合劑中治療CHB 的有效成分152 個，潛在作用靶點127個。“赤茵合劑-有效成分-靶點-CHB”網(wǎng)絡(luò)圖分析得知槲皮素、丹參酮IIA、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、和山柰酚、木犀草素等能連接到較多的靶點，可能是赤茵合劑治療CHB 的關(guān)鍵有效成分。槲皮素是茵陳、苦參和甘草的共有成分，有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以減少乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和乙肝e 抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）的分泌，降低HBV 基因組DNA 的水平，進一步探究發(fā)現(xiàn)槲皮素對HBV 的復(fù)制也有抑制作用，具有保護肝臟的作用[11-12]。有研究表明芒柄花黃素可以顯著抑制肝癌細胞中COX-2 和cyclin D1 的表達，將細胞阻滯在G0/G1 期，抑制肝癌的發(fā)生[13]。山柰酚則可通過下調(diào)IL-6 與TNF-α 的水平，減輕肝臟炎癥反應(yīng)損傷[14]。丹參酮IIA 可將細胞阻滯在G0/G1 期，誘導(dǎo)細胞凋亡。研究表明丹參酮IIA 可以抑制多種人類癌癥的增殖，包括肝細胞癌[15]。木犀草素可降低HBsAg、HBeAg、HBV DNA 復(fù)制中間體水平，以及HBsAg 和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg） 的表達[16]，能夠抑制肝星狀細胞HSCs 的遷移，拮抗肝臟纖維化[17]。結(jié)果顯示，赤茵合劑可能通過抗炎、抑制HBV 復(fù)制、抗纖維化等多途徑實現(xiàn)治療CHB 的目標(biāo)[18]。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到TP53、AKT1、PTGS2、TNF、IL6、JUN、STAT3、1L1B 等核心靶點，可能是赤茵合劑治療CHB 的核心靶點。TP53 能誘導(dǎo)細胞周期阻滯、凋亡和衰老，進而抑制腫瘤的發(fā)展[19]。TP53 是人類癌癥中最常發(fā)生突變的基因之一[20]，當(dāng)TP53 發(fā)生突變時，會導(dǎo)致細胞增殖異常，從而促進癌癥發(fā)生[21]。AKT1 是人類腫瘤中重要的調(diào)節(jié)因子，慢病毒介導(dǎo)Akt1 shRNA 載體可抑制肝癌HepG2 細胞增殖和侵襲，并促進其凋亡，進而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[22]。PTGS2，又名COX-2，相關(guān)研究[23-24]已經(jīng)證明，COX-2 通過抑制凋亡和誘導(dǎo)增殖促進肝癌細胞系的生長。c-Jun通過細胞自主方式調(diào)節(jié)肝臟骨橋蛋白（Opn）表達，在HBV 相關(guān)腫瘤發(fā)生過程中通過促進肝細胞增殖和不典型增生的進展發(fā)揮重要作用[25]。STAT3 作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子，經(jīng)磷酸化激活后可誘導(dǎo)細胞中癌基因的異常表達，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。HBV 通過下調(diào)miR-340-5p 表達，誘導(dǎo)STAT3 過表達，促進肝癌細胞遷移[27]。IL-1B 是一種促炎細胞因子，通過氧化應(yīng)激抑制HBV 復(fù)制發(fā)揮抗病毒作用[28]。TNF-α是參與HBV 感染免疫應(yīng)答的最重要的細胞因子之一[29]，被認為是HBV 感染的關(guān)鍵因素，可促進免疫介導(dǎo)的病毒學(xué)控制[30]，抑制HBV 在肝臟中的表達和復(fù)制，從而誘導(dǎo)清除HBV[31]。IL6 是動態(tài)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，可與IL8 共同促進炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)，參與乙型肝炎的炎癥反應(yīng)，使吞噬細胞吞噬游離的乙肝病毒和乙肝病毒感染的細胞[32]。

KEGG 富集結(jié)果顯示，顯示赤茵合劑的成分可作用于Hepatitis B 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等，這表明赤茵合劑可能通過免疫細胞分化和調(diào)控免疫應(yīng)答參與調(diào)控CHB 進程。Hepatitis B 通路是其中一種顯著富集的信號通路，通過調(diào)控下游的AKt 蛋白，作用于PI3KAkt 通路，進而調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子TP53，再作用于TP53 信號通路的caspase3 蛋白，進而阻斷TGFβ 誘導(dǎo)的干細胞凋亡，達到抑制肝癌的進展的目的[33]。Hepatitis B 信號通路通過調(diào)控下游的HBx 蛋白，可激活MAPK 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)揮抑制腫瘤抑制蛋白p53 的作用，同時具備抑制細胞凋亡和前凋亡的功能[34]。結(jié)果表明，赤茵合劑藥物成分可能通過調(diào)控乙型肝炎通路中多種蛋白的表達，參與肝細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，從而減緩HBV 病程的進展[35]。絕大多數(shù)病毒都會通過調(diào)控PI3K-Akt 信號通路，調(diào)節(jié)病毒在早期感染的活力[36]。研究表明，MAPK 信號通路參與炎癥反應(yīng)、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤侵襲等多種生物學(xué)過程[37]。綜合分子對接結(jié)果分析，丹參酮IIA、槲皮素、木犀草素可能為赤茵合劑治療CHB 的關(guān)鍵核心成分，PTGS2、JUN、STAT3、1L1B 可能為赤茵合劑治療CHB 的關(guān)鍵核心靶點。

綜上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，預(yù)測出赤茵合劑治療CHB 的主要有效成分包括丹參酮IIA、槲皮素、木犀草素等，可能通過參與RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控等發(fā)揮治療CHB 的作用，其機制可能與Hepatitis B、PI3KAkt、MAPK、TNF 等相關(guān)炎癥信號通路和病毒感染信號通路相關(guān)，有助于從新的角度挖掘赤茵合劑治療CHB 的潛在價值，為后續(xù)進一步的生物實驗研究與臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測的潛在有效成分是由藥物有效成分和疾病靶點對比映射后所得，隨著有效成分的篩選條件及所研究疾病的改變，可能導(dǎo)致中藥復(fù)方中公認的有效成分未入選。且中藥方劑以中醫(yī)藥理論的配伍為基礎(chǔ)，各中藥協(xié)同發(fā)揮治療作用，機制復(fù)雜，并不是將單獨的中藥材分解成已知化學(xué)成分簡單的加和，未入選的有效成分作用也不可忽略。研究發(fā)現(xiàn)，許多生物利用度低的中藥成分在腸道聚集的濃度高于血藥濃度，由于腸道菌群的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，這些中藥才能夠發(fā)揮良好的療效。對于那些生物利用度低及血藥濃度低的中藥來說，只以O(shè)B 和DL作為篩選，考慮欠全面，且忽視了成分含量對藥效影響和成分之間的相互作用。鑒于以上所述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，赤茵合劑治療CHB 的作用機制是否與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致，將來需要進一步的生物實驗來驗證預(yù)測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。