黃益穗，鐘文嘉，劉灼波

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

鴉膽子油為鴉膽子藥用的主要有效部位，具有清熱、解毒、截瘧等功效［1］及抗腫瘤、抗炎、抗醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)等藥理作用［2］，臨床可用于乳腺癌［3］、肝癌［4］、肺癌［5］等疾病的治療。鴉膽子油具有脂溶性，口服后胃腸道不易吸收，制成水包油（O/W）型微乳，可增加其吸收性。微乳制劑為乳化劑、助乳化劑、水相、油相按一定配比經(jīng)攪拌形成的澄清溶液，平均粒徑為10～100 nm，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。體系由混濁變澄清為微乳由油包水（W/O）型完全轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W 型即為轉(zhuǎn)相，轉(zhuǎn)相時(shí)2 種乳化劑的量（或含水量）即為臨界點(diǎn)，可以目測(cè)法［6-7］測(cè)定；也可建立電導(dǎo)率-含水量曲線［8-9］，采用滲濾電導(dǎo)模型（以下稱電導(dǎo)率-含水量曲線法）［10］測(cè)定。本研究中通過(guò)測(cè)定鴉膽子油微乳的平均粒徑和多分散系數(shù)（PDI），證實(shí)電導(dǎo)率- 含水量曲線法測(cè)定的臨界點(diǎn)比目測(cè)法更精確，并通過(guò)繪制偽三元相圖及采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鴉膽子油微乳制備工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Hitachi HT7700型電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS90 型分析儀（英國(guó)Malvern公司）；MS603S 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；DDS-11A 型電導(dǎo)率儀（上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司）；RO + EDI - KK - 1 型純化水機(jī)（廣州萬(wàn)冠制藥設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

鴉膽子油（湖北漢達(dá)飛生物科技有限公司，批號(hào)為21091401）；聚乙二醇400（PEG400）、吐溫80（TW80）、油酸（OA），均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)分別為20211215，20211101，20210801；肉豆蔻酸異丙酯（IPM，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)為1811858）；所有試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 微乳相臨界點(diǎn)測(cè)定

2.1.1 處方制備

分別以鴉膽子油/OA（1∶1、1∶2，m/m），鴉膽子油/IPM（1∶1、1∶2，m/m）作為混合油相取代空白處方中OA和IPM，共得6 個(gè)處方（編號(hào)為Ⅰ- Ⅵ），詳見(jiàn)表1。其中RH40為聚氧乙烯氫化蓖麻油。

表1 空白微乳和鴉膽子油微乳處方Tab.1 Prescriptions of blank microemulsion and Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion

2.1.2 方法建立

電導(dǎo)率- 含水量曲線法：將乳化劑和助乳化劑按比例混勻，加入油相，600 r/min 磁力攪拌10 min，獲得4 g 的微乳原液；加入0.2 g 水，600 r/ min 攪拌20 s，測(cè)定電導(dǎo)率和含水量，記錄，重復(fù)上述步驟，直至微乳含水量為80%；采用Origin 2021 軟件繪制電導(dǎo)率- 含水量曲線，以電導(dǎo)率最大值對(duì)應(yīng)的含水量為臨界點(diǎn)。

目測(cè)法：同法制得4 g 微乳原液；緩慢加入水，攪拌，觀察，重復(fù)上述操作，直至溶液由混濁變澄清，記錄加水量，即為臨界點(diǎn)。上述操作均由3 名實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行，平行3次，結(jié)果取平均值。

2.1.3 結(jié)果比較

將2種方法測(cè)得臨界點(diǎn)按表1中的5個(gè)處方重新配制微乳，各取適量，分別滴入亞甲基藍(lán)和蘇丹Ⅲ，靜置，觀察。結(jié)果亞甲基藍(lán)在上述微乳中的擴(kuò)散速度均大于蘇丹Ⅲ，且后者在微乳表面停留幾乎不擴(kuò)散，表明上述微乳均為O/W 型。進(jìn)一步比較微乳的粒徑和PDI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電導(dǎo)率- 含水量曲線法測(cè)得的臨界點(diǎn)含水量更高，且微乳的平均粒徑和PDI更小，體系更穩(wěn)定，微乳已完全轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型；目測(cè)法測(cè)得的微乳尚處于W/O和O/W 雙連續(xù)型，未完全轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W 型［11］。比較按不同處方（Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ）制備的微乳，結(jié)果油相為鴉膽子油/OA（1︰1，m/m）和鴉膽子油/IPM（1︰1，m/m）時(shí)，微乳的平均粒徑和PDI均更小，體系更穩(wěn)定。詳見(jiàn)表2、圖1。

圖1 處方Ⅱ電導(dǎo)率-含水量曲線Fig.1 Conductivity-water content curve of prescription Ⅱ

表2 電導(dǎo)率-含水量曲線法和目測(cè)法制備結(jié)果比較Tab.2 Comparison of the determination results of conductivitywater content curve method and visual determination method

2.2 制備工藝優(yōu)化

2.2.1 偽三元相圖

乳化劑、助乳化劑、油相：以鴉膽子油/OA（1︰1，m/m）和鴉膽子油/ IPM（1︰1，m/m）為混合油相，RH40 和TW80 為乳化劑，1，2-丙二醇、PEG400、無(wú)水乙醇為助乳化劑。固定乳化劑和助乳化劑的比值（Km）為2，總?cè)榛瘎┖陀拖噘|(zhì)量比分別為9︰1、1︰9、8︰2、2︰8、7︰3、3︰7、6︰4、4︰6、5︰5，在室溫下采用電導(dǎo)率-含水量曲線法配制微乳，計(jì)算穩(wěn)定微乳處方中總?cè)榛瘎⒂拖?、水相的占比；采用Origin 2021 軟件繪制偽三元相圖，詳見(jiàn)圖2（圖中黑色部分為微乳區(qū)域，圖3 同）。結(jié)果含油量為10%～60%（即總?cè)榛瘎┖陀拖嗟馁|(zhì)量比分別為9︰1、8︰2、7︰3、6︰4、4︰6、5︰5）時(shí)可獲得穩(wěn)定微乳；油相、乳化劑、助乳化劑分別為鴉膽子油/OA =（1︰1，m/m）、RH40、無(wú)水乙醇時(shí)偽三元相圖微乳區(qū)域面積最大，故選定其為最優(yōu)處方類型。

圖2 不同配比穩(wěn)定鴉膽子油微乳偽三元相圖A.Yadanziyou Oleum Bruceae/IPM，TW80，absolute alcohol B.Yadanziyou Oleum Bruceae/IPM，RH40，absolute alcohol C.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，RH40，1，2-propanediol D.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，RH40，PEG400 E.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，RH40，absolute alcohol F.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，TW80，PEG400Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram of stable Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion with different ratios

圖3 不同Km的穩(wěn)定鴉膽子油微乳偽三元相圖A.Km= 1.5 B.Km = 2.5 C.Km= 3 D.Km = 3.5Fig.3 Pseudo-ternary phase diagram of stable Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion with different Km

Km：將處方鴉膽子油/OA = 1︰1（m/m），RH40、無(wú)水乙醇，按Km（RH40/無(wú)水乙醇）分別為1，1.5，2，2.5，3，3.5，總?cè)榛瘎┖陀拖噘|(zhì)量比分別為上述比例時(shí)，在室溫下采用上述方法配制微乳，并繪制偽三元相圖（圖3）。結(jié)果，Km>3.5 或Km<1.5 時(shí)，配制的微乳易出現(xiàn)分層，予以剔除，故選定最大Km為3.5，最小Km為1.5。

2.2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)［12］

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以鴉膽子油用量（因素A，%）、Km（因素B）為考察因素，平均粒徑、PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化；以含油量為10%～60%，鴉膽子油與OA的質(zhì)量比1︰1計(jì)算，鴉膽子油的實(shí)際用量為5%～30%。因素與水平見(jiàn)表3。采用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析（表4）。

表3 因素與水平Tab.3 Factors and their levels

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and results of the CCD-RSM

模型擬合：采用Design-Expert 12.0軟件求得擬合方程Y平均粒徑=27.278+16.661A-2.866B-1.583AB+3.829A2+ 1.606B2，YPDI= 0.087 + 0.050A- 0.011B-0.007AB+ 0.023A2+ 0.010B2，精確度均小于10%，提示真實(shí)度和可信度均較高［13］。

方差分析：對(duì)2 個(gè)模型的回歸參數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5 和表6，獲得的平均粒徑、PDI 的模型極顯著（P< 0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P> 0.05），提示上述模型對(duì)真實(shí)情況的模擬較準(zhǔn)確［14-15］。

表5 平均粒徑的方差分析結(jié)果Tab.5 Results of the ANOVA of average particle size

表6 PDI的方差分析結(jié)果Tab.6 Results of the ANOVA of PDI

效應(yīng)面分析：采用Design-Expert 12.0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，得平均粒徑、PDI 與各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖（圖4）。

圖4 平均粒徑、PDI與各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖a.Average particle size b.PDIFig.4 Three-dimensional response surface diagram of the interaction of average particle size，PDI with various factors

驗(yàn)證試驗(yàn)：驗(yàn)證最優(yōu)工藝，平行3次，結(jié)果與預(yù)測(cè)值（平均粒徑為14.19 nm，PDI為0.063）接近，RSD分別為1.14%和5.64%（n= 3）。詳見(jiàn)表7。故鴉膽子油微乳最優(yōu)制備工藝為油相（鴉膽子油8.66%、OA 8.66%）占比為17.32%，乳化劑（RH40）占比為60.81%，助乳化劑（無(wú)水乙醇）占比為21.87%，含水量為71.01%。在此工藝下制得的微乳平均粒徑最小。

表7 工藝驗(yàn)證結(jié)果（n=3）Tab.7 Results of the verification test of process（n=3）

2.3 理化性質(zhì)考察

電鏡圖：取“驗(yàn)證試驗(yàn)”項(xiàng)下制得的微乳適量，滴至有支持膜覆蓋的銅網(wǎng)上，靜置15 min；用濾紙吸干，滴入2%磷鎢酸負(fù)染，靜置10 min；用濾紙吸干剩余液體，將樣品置生物透射電鏡下觀察。結(jié)果顯示，微乳外觀圓潤(rùn)、規(guī)整，色澤均一。詳見(jiàn)圖5。

圖5 鴉膽子油微乳電鏡圖Fig.5 Image of electron-microscopy of Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion

類型鑒別［16］：取上述微乳適量，分別滴加10 滴亞甲基藍(lán)和蘇丹Ⅲ，靜置30 min。結(jié)果亞甲基藍(lán)幾乎在整個(gè)鴉膽子油微乳體系中擴(kuò)散，蘇丹Ⅲ幾乎不擴(kuò)散，表明該微乳為O/W型。詳見(jiàn)圖6。

圖6 鴉膽子油微乳類型鑒別圖Fig.6 Identification of type of Yadanziyou Oleum Bruceae micro?emulsion

高速離心：取上述微乳適量，5 000 r/min離心30 min，結(jié)果微乳澄清透明、未出現(xiàn)分層，表明鴉膽子油微乳穩(wěn)定性良好。

室溫靜置：取上述微乳適量，室溫下靜置，分別于第30，60 天取出。測(cè)得微乳的平均粒徑分別為（14.63±0.07）nm 和（15.38 ± 0.13）nm，PDI 分別為0.064 ±0.005 和0.068 ± 0.008，表明鴉膽子油微乳穩(wěn)定性良好。

3 討論

本研究中所得偽三元相圖中的微乳區(qū)域偏小，原因?yàn)椋?）與目測(cè)法相比，電導(dǎo)率-含水量曲線法測(cè)定的O/ W 型微乳臨界點(diǎn)含水量更高，微乳區(qū)域變窄。2）部分微乳出現(xiàn)假陽(yáng)性，即剛配制出來(lái)，外觀澄清透明，測(cè)得平均粒徑為10～100 nm，靜置24 h 后體系變混濁。主要由于乳化劑、助乳化劑和油相類型或占比不匹配，或油相占比高，乳化劑、助乳化劑不能將其完全包裹，造成微乳粒徑偏大，穩(wěn)定性一般，長(zhǎng)時(shí)間靜置后，粒子間重新聚集形成膠束，導(dǎo)致體系變混濁。3）油相占比過(guò)低，乳化劑、助乳化劑占比過(guò)高，多余的乳化劑、助乳化劑不能完全溶于水，飄浮在液面出現(xiàn)分層，不能形成穩(wěn)定微乳。

綜上所述，本研究中優(yōu)化的工藝操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為鴉膽子油微乳的工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。