張鑫 劉朔 李苗苗 王鳳琦 張仁偉 劉世國

［摘要］ 目的 探究菏澤地區(qū)新生兒葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥患病率特點及其基因突變的特點。

方法 應(yīng)用GSP全自動熒光免疫分析儀，對2021年1—12月在菏澤地區(qū)出生的新生兒G6PD活性進行篩查。使用天根生物DP334（離心柱型）試劑盒對確診病兒的干血斑標本提取基因組DNA，采用PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)進行G6PD基因全部外顯子測序，分析菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥基因突變類型與特點。

結(jié)果 菏澤地區(qū)77 141例新生兒中檢測出G6PD缺乏癥確診病兒54例，患病率為0.07%；54例病兒的G6PD基因全部外顯子突變共檢出13種突變類型，基因突變檢出率為100%。首次在中國人群中發(fā)現(xiàn)1個G6PD基因內(nèi)含子變異：G6PD c.486－7C＞G；其余12種是已有報道的中國人群G6PD突變類型。其中男性半合子13型，女性雜合子4型。81.48%的G6PD突變位于12、6、9、2號外顯子上，其中c.1388G＞A、c.487G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G、c.1024C＞T占77.78%，菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥的基因突變熱點依次為：c.1388G＞A（29.63%）、c.487G＞A（22.22%）、c.1376G＞T（11.11%）。

結(jié)論 菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥患病率和基因突變的類型有其地域特點。

［關(guān)鍵詞］ 葡糖磷酸脫氫酶缺乏；熒光免疫分析；DNA突變分析；嬰兒，新生

［中圖分類號］ R722.11

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0174－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.050

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）］

［ABSTRACT］ Objective To investigate the prevalence rate and gene mutations of glucose－6－phosphate dehydrogenase （G6PD） deficiency in neonates in Heze， China.

Methods GSP automatic fluorescence immunoassay system was used for the screening of G6PD activity in the neonates born in Heze from January to December， 2021. Tiangen Biological DP334 （centrifugal column） kit was used to extract genomic DNA from the dried blood spot samples from the children with a confirmed diagnosis， and the direct PCR product sequencing technique was used for the sequencing of all exons of the G6PD gene to investigate the types and characteristics of gene mutation in G6PD deficiency in Heze.

Results Among the 77 141 neonates in Heze，54 were diagnosed with G6PD deficiency， with a prevalence rate of 0.07%， and 13 mutation types were detected in all exon mutations of the G6PD gene， with a detection rate of 100%. One intron variation of the G6PD gene， G6PD c.486－7C>G， was found for the first time in the Chinese population， and the other 12 mutations of the G6PD gene had been reported in the Chinese population. Among these mutations， there were 13 hemizygous mutations in males and 4 heterozygous mutations in females. The analysis showed that 81.48% of G6PD mutations were located in exons 12，6，9 and 2， among which c.1388G>A， c.487G>A， c.1376G>T， c.95A>G， and c.1024C>T accounted for 77.78%. The hot spots of mutation in neonates with G6PD deficiency in Heze were c.1388G>A （29.63%）， c.487G>A （22.22%）， and c.1376G>T （11.11%）.

Conclusion The prevalence rate and gene mutation types of neonatal G6PD deficiency in Heze have their own regional characteristics.

［KEY WORDS］ glucosephosphate dehydrogenase deficiency; fluoroimmunoassay; DNA mutational analysis; infant， newborn

葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是一種常見的、由G6PD基因突變而導(dǎo)致的X性連鎖不完全顯性的遺傳性紅細胞酶缺陷病，在臨床上導(dǎo)致溶血性貧血的發(fā)生。G6PD基因位于X染色體長臂2區(qū)8帶（Xq28），由13個外顯子（其中第1個外顯子屬于非編碼）和12個內(nèi)含子組成，編碼515個氨基酸長度的蛋白質(zhì)。G6PD是一個關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)酶，其功能是調(diào)節(jié)糖酵解并在磷酸戊糖途徑（PPP）的過程中產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），而這也是NADPH的主要的來源途徑。

G6PD基因突變后，攜帶該突變基因的女性可將突變的等位基因傳遞給其子或女，而對于父親來說只能傳遞給女兒。依據(jù)酶活性和臨床表現(xiàn)，WHO將G6PD缺乏癥分為Ⅰ～Ⅴ共5級。本研究對菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥篩查患病率及基因突變情況進行分析，旨在為該病的篩查、診斷、治療等提供參考。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2021年1—12月，選取在菏澤地區(qū)出生的共計77 141例新生兒作為研究對象，通過GSP全自動熒光免疫分析儀篩查并召回檢測確診的G6PD缺乏癥病兒。本文研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準實施，家長均在新生兒疾病篩查前簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 檢測儀器 GSP全自動熒光免疫分析儀（GSP，Genetic Screening Processor，型號為2021－0010）；美國萊伯特LABNET Enduro水平電泳系統(tǒng)；美國UV凝膠成像系統(tǒng)（BIO－RAD）；PCR擴增儀（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler，美國）；ABI Prism 3730XL型基因分析儀（DNA測序儀，美國ABI公司）。

1.2.2 試劑盒 G6PD測定試劑盒（GSP Neonatal G6PD kit，熒光分析法）；干血斑DNA提取試劑盒（TIANamp Blood Spots DNA Kit，離心柱型）；莊盟ZOMANBIO DL 2000 Plus DNA Marker；諾唯贊Vazyme 2×Rapid Taq Master Mix試劑盒。

1.3 研究方法

1.3.1 G6PD缺乏癥篩查方法 采集新生兒足跟血液，要求：①于新生兒生后72 h～7 d之內(nèi)采血；②采血前必須充分哺乳6次以上；③血液直接滴到濾紙上制備血片，自然晾干，避免污染，晾干后4 ℃或冷凍密封保存。應(yīng)用GSP全自動熒光免疫分析儀，檢測新生兒血G6PD水平。若新生兒血紅蛋白G6PD<27 U/g，打電話召回重新采集足跟血制備干血斑片復(fù)查，如果3次復(fù)查（間隔1周）血紅蛋白G6PD均<27 U/g則確診為G6PD缺乏癥。

1.3.2 DNA提取 嚴格按照干血斑DNA提取試劑盒的方法提取病兒干血斑片的基因組DNA，取2 μL，在核酸蛋白分析儀上檢測其濃度和純度。

1.3.3 基因突變檢測 根據(jù)NCBI Reference Sequence：NM_001360016.2設(shè)計G6PD引物序列，應(yīng)用primer express 3.0設(shè)計9對引物，擴增產(chǎn)物長500～896 bp，其中Exon3～4、Exon6～7、Exon9～10、Exon11～12合并擴增，見表1。構(gòu)建PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1.0 μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，蒸餾水5.5 μL，提取的DNA樣品溶液5.0 μL。反應(yīng)條件：先50 ℃孵育2 min，然后95 ℃孵育3 min；95 ℃變性15 s， 60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，經(jīng)歷35次循環(huán)；之后75 ℃延伸5 min。擴增完成以后，取PCR擴增產(chǎn)物3 μL，在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，反應(yīng)條件為：110 V，35 min。電泳完成后，使用凝膠成像儀成像，經(jīng)鑒定是本研究所需要的DNA片段后，送青島派森諾基因科技有限公司進行一代基因測序并分析。

2 結(jié)果

2.1 菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥患病率的特點

菏澤地區(qū)2021年1—12月出生的7 7141例新生兒中，經(jīng)篩查并確診G6PD缺乏癥病兒54例，總患病率為0.07%，其中男50例，女4例。菏澤地區(qū)各縣區(qū)G6PD缺乏癥的患病率情況見表2。根據(jù)WHO的分類標準，Ⅱ類占1.85%，Ⅲ類占74.07%，Ⅳ類占24.07%。見表3。

2.2 菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥基因突變的情況

對54例確診病兒進行G6PD基因全部外顯子測序分析顯示，基因突變檢出率為100%，共發(fā)現(xiàn)13種突變類型，其中12種G6PD突變類型在中國人群中已報道過，分別為：c.1388G＞A，c.487G＞A，c.1376G＞T，c.95A＞G，c.1024C＞T，c.871G＞A，c.392G＞T，c.1192G＞A，c.486－34delT，c.1360C＞T，c.592C＞T，c.196T＞A；1種為在中國人群中未見報道的內(nèi)含子變異：Intron5上c.486－7C＞G（圖1）；其中男性半合子13型，女性雜合子4型。81.48%的G6PD突變位于12、6、9、2號外顯子上，其中c.1388G＞A、c.487G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G、c.1024C＞T占77.78%，菏澤地區(qū)的突變熱點依次為：c.1388G＞A 29.63%，c.487G＞A 22.22%，c.1376G＞T 11.11%。見表4。

3 討論

常規(guī)檢測G6PD缺乏癥酶學(xué)的技術(shù)有很多，常用的篩查方法包括G6PD全自動熒光免疫分析法、硝基四氮唑藍紙片實驗方法、G6PD/6PGD比率法、高鐵血紅蛋白還原試驗等。G6PD/6PGD比率法是WHO推薦的G6PD缺乏癥篩查方法，該方法操作比較簡單，檢測結(jié)果的準確度也比較高，而且具有可檢測出更多的雜合子類型的優(yōu)點，所以該方法在國際上應(yīng)用非常廣泛。除了可以進行G6PD酶活性定量的檢測，也可以對G6PD缺乏癥的基因突變進行PCR產(chǎn)物直接測序，更加有利于在分子水平上對G6PD缺乏癥進行分析研究。另外，由于全自動熒光免疫分析法可檢測樣本量大和自動化程度比較高，特異度與靈敏度也比較高，目前，該法在臨床上對新生兒遺傳代謝性疾病篩查中已被大多數(shù)的實驗室所采用。WHO Ⅰ類酶活性范圍為0，病人臨床表現(xiàn)為無明顯誘因情況下就會出現(xiàn)中度貧血、黃疸，肝脾大；Ⅱ類酶活性的范圍一般<10%，會出現(xiàn)間斷性的溶血發(fā)作，在食用某些食物（如蠶豆）、感染、氧化藥物和一些草藥可能會誘發(fā)急性溶血；Ⅲ類酶活性范圍為 10%～60%，病人臨床表現(xiàn)為少數(shù)伯氨喹類藥物或者感染可以引發(fā)溶血；Ⅳ類酶活性范圍＞60%，病人無特殊臨床表現(xiàn)；Ⅴ類酶活性范圍＞200%，病人無特殊臨床表現(xiàn)。相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，世界上G6PD缺乏癥病人大約有4億人，呈全球性分布，總患病率約5%。另外有研究顯示，1990—2013年，每年平均有4 100人因為G6PD缺乏癥而死亡。從全世界來看，G6PD缺乏癥分布呈現(xiàn)出不平衡的狀態(tài)，在北美和歐洲發(fā)生率低于3%，而在非洲、亞洲、南美洲部分地區(qū)、地中海、中東等熱帶和亞熱帶地區(qū)發(fā)病率顯著增加，其發(fā)病率可高達15%～26%。我國新生兒遺傳代謝病篩查（NBS）始于20世紀80年代，G6PD缺乏癥在我國兒童總體患病率為4.03%。我國華南及西南各地區(qū)如廣東、廣西、云南、海南等G6PD缺乏癥常見，是該病的高發(fā)區(qū)之一，并呈“南高北低”的梯度分布趨勢。文獻報道，廣東省G6PD缺乏癥兒童患病率為3.1%～16.1%，廣西為7.40％，云南省為7.39%，貴州省為3.43%；而G6PD缺乏癥在我國北方地區(qū)的山東青島（患病率為0.02%）、山東聊城（患病率為0.02%）、陜西寶雞（患病率為0.02%）、河北省石家莊（患病率為0.05%）患病率較低。本研究表明2021年1—12月菏澤地區(qū)G6PD缺乏癥總患病率為0.07%，與該病發(fā)生率具有種族及地域差異、在我國存在“南高北低”的特點相符。本文研究結(jié)果顯示，G6PD缺乏癥鄆城縣和鄄城縣患病率為0.12%，巨野縣患病率為0.01%，表明菏澤地區(qū)各縣區(qū)新生兒G6PD缺乏癥篩查患病率亦有地域差異性。

目前，全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在約220種G6PD基因缺陷等位基因，其分布具有明顯的地區(qū)和民族異質(zhì)性等特點。既往有研究表明，緬甸地區(qū)常見的G6PD基因突變?yōu)閏.487G＞A，在非洲地區(qū)人群中G6PD基因突變常見的類型則以c.202G＞A、c.變?yōu)閏.563G＞T，泰國和馬來西亞常見的基因突變?yōu)閏.871G＞A，印尼安汶人中常見的基因突變?yōu)閏.383T＞C，夏威夷州菲律賓裔居民常見的基因突變?yōu)閏.1360C＞T。而在我國，G6PD缺乏癥的患病率和基因突變類型明顯具有地域和群體特異性。中國人突變位點主要是c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G，分布在我國多個民族中。本研究共檢出13種突變類型，其中有12種G6PD突變類型c.1388G＞A、c.487G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G、c.1024C＞T、c.871G＞A、c.392G＞T、c.1192G＞A、c.486－34delT、c.1360C＞T、c.592C＞T、c.196T＞A在中國人群中已報道過；菏澤地區(qū)的突變熱點依次為：c.1388G＞A（29.63%）、c.487G＞A（22.22%）和c.1376G＞T（11.11%）。通過檢索MasterMind和NCBI Clinvar以及中國國家基因組數(shù)據(jù)庫，本研究發(fā)現(xiàn)1種在中國人群中未見報道的G6PD基因內(nèi)含子變異：c.486－7C＞G，該例病兒只有此1種基因變異，并且在Exon6前7個堿基處發(fā)生堿基替換，可能影響G6PD蛋白的剪接，為可能致病變異。提示菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥基因突變的類型有其地域特點。

綜上所述，菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥患病率較低，為0.07%；G6PD缺乏癥患病率和基因突變的類型有地域特點，通過對G6PD基因全部外顯子進行測序能夠進一步明確基因突變位點的分布情況。本研究發(fā)現(xiàn)了1種G6PD基因新突變，豐富了G6PD基因突變的數(shù)據(jù)庫，為該病的預(yù)防以及治療提供了更加豐富的可供臨床參考的資料。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）