何貴府,柏家果,余科辰,陸穎,黃偉堅(jiān),韋祖樟,陳櫻,歐陽康*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣西高校動物疫病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530005;2.廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心,廣西 南寧 530005; 3.廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530005)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病[1]。各個階段、不同品系的豬群均易感染PEDV[2],嚴(yán)重危害1～10日齡的仔豬[3],主要臨床癥狀為水樣腹瀉、嘔吐、食欲不振、脫水甚至死亡[4,5]。自家組織滅活苗和反飼是防控PED常用手段[6],這兩種方法對本場疾病更具有針對性。自家組織滅活苗安全性較好,但病料組織在滅活過程中病毒的免疫原性容易受到影響,從而導(dǎo)致免疫效果不明顯,需要大劑量或添加佐劑來增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答[7]。反飼是將豬場發(fā)病仔豬新鮮腸道組織及其內(nèi)容物,以口服的方式免疫母豬群,哺乳仔豬則可以通過被動免疫的方式,吸食初乳獲得更高滴度的母源抗體。與自家組織滅活苗相比,反飼免疫效果更好,免疫期持續(xù)時間更長,缺點(diǎn)是安全性較低[8]。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過對本案例的論述與分析總結(jié),提高生豬養(yǎng)殖企業(yè)對PED的認(rèn)識,并為PED的防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 豬場背景信息及免疫程序

廣西某規(guī)?；N豬場存欄PIC品系經(jīng)產(chǎn)母豬1600頭左右,月平均斷奶仔豬2600頭左右,保育豬和育肥豬各存欄3500頭左右。PED免疫程序:2021年,懷孕母豬產(chǎn)前10d,肌內(nèi)注射自家組織滅活苗4mL/頭,后備母豬入經(jīng)產(chǎn)母豬群前肌內(nèi)注射自家組織滅活苗4mL/頭。2022年,懷孕母豬產(chǎn)前30d和10d,肌內(nèi)注射自家組織滅活苗4mL/頭,并對180日齡左右的后備母豬進(jìn)行反飼和入經(jīng)產(chǎn)母豬群前免疫自家組織滅活苗4mL/頭。

1.2 產(chǎn)房仔豬死亡率數(shù)據(jù)的收集

由養(yǎng)殖場內(nèi)生產(chǎn)人員負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì),場內(nèi)統(tǒng)計(jì)員匯總。

1.3 PED病原檢測樣品和全血樣品的采集和處理

PED病原檢測樣品包括腹瀉糞便樣品和環(huán)境樣品,樣品加入一定量的生理鹽水,10000r/min離心2min后取上清液。全血樣品的采集和處理,保育和育肥階段豬只血液采集自前腔靜脈,母豬血液采集自耳緣靜脈,4～8h內(nèi)分離并收集血清。以上樣品均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原檢測

使用磁珠法核酸提取試劑盒(購自廣州美基生物有限公司)提取樣品核酸,再使用PEDV熒光PCR試劑盒(購自廈門普康同創(chuàng)生物科技公司)進(jìn)行PED抗原檢測。將試劑盒凍干粉以180μL凍干回溶液回溶并充分震蕩混勻,取上述溶液20μL加入樣品核酸5μL和陰性、陽性對照,進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。結(jié)果判定:腹瀉糞便樣品中,Ct值≤37,樣本判定為陽性;無Ct值,樣本判定為陰性;37

1.5 IgG抗體檢測

使用PED IgG ELISA檢測試劑盒(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)對血清樣品進(jìn)行檢測,抗原板加入1∶80稀釋的血清120μL,37℃孵育30min,250μL洗滌液洗滌3次;加入100μL酶標(biāo)記物,37℃孵育30min,250μL洗滌液洗滌3次;加入底物TMB 50μL,37℃避光顯色15min;加入50μL終止液終止顯色?；靹?在450nm波長下讀取OD值。結(jié)果判定:陽性對照OD450 nm值≥0.55,陰性對照OD450 nm值<0.10,實(shí)驗(yàn)成立。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2019軟件進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)和整理,用GraphPad prism 8進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析,利用Ordinary one-way AVOVA進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)房仔豬死亡率

產(chǎn)房仔豬死亡率結(jié)果顯示(圖1),2021年10月和12月產(chǎn)房仔豬死亡率較高,分別達(dá)到25.33%和20.79%,其中10月的高死亡率是由于豬價下行豬場進(jìn)行控欄,主動對仔豬進(jìn)行安樂死所致,而12月的仔豬高死亡率則是由于暴發(fā)了PED。據(jù)統(tǒng)計(jì),PED暴發(fā)期間,豬場腹瀉最嚴(yán)重的棟舍產(chǎn)仔數(shù)為416頭,仔豬死亡數(shù)為298頭,死亡率高達(dá)71.63%(圖示未給出)。2021年5月、6月和11月,產(chǎn)房仔豬死亡率較低,分別為6.58%、6.63%和6.78%,2022年產(chǎn)房仔豬死亡率穩(wěn)定在10.5%左右。

圖1 2021年4月—2022年6月廣西某豬場產(chǎn)房仔豬死亡率和豬價統(tǒng)計(jì)

2.2 PED病原檢測

使用RT-qPCR對腹瀉糞便樣品和環(huán)境樣品進(jìn)行PED病原檢測,獲得的數(shù)據(jù)用Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和整理。結(jié)果顯示(表1),整體上看,從2021年第三季度到2022年第二季度,總共檢測數(shù)量為1083份,陽性率為19.21%,Ct值均值為31.25。從時間上看,2021年第三季度到2022年第二季度的PEDV陽性率分別為33.09%、17.06%、31.49%和2.46%。從樣品來源上看,PEDV陽性率從高至低排列是保育豬、環(huán)境樣品、哺乳仔豬和育肥豬,分別為39.82%、24.47%、18.63%和11.17%。值得注意的是,從2021年第三季度到2022年第二季度,哺乳仔豬腹瀉樣品的PEDV檢出率分別為50.43%、15.22%、11.76%和0,呈下降趨勢。

表1 廣西某規(guī)?；N豬場腹瀉和環(huán)境樣品的PED RT-qPCR病原檢測結(jié)果

2.3 PED IgG抗體檢測

使用試劑盒對不同階段豬只血清樣品進(jìn)行PED抗體檢測,結(jié)果顯示(圖2),懷孕母豬的PED抗體OD值高于保育豬和育肥豬,其中,懷孕母豬2021年第三季度抗體水平顯著高于其他3個季度(P<0.05),2021年第四季度抗體水平最低,且顯著低于2021年第三季度和2022年第一季度(P<0.05)。保育豬2021年第四季度抗體水平最低,顯著低于2021年第二季度和2021年第三季度(P<0.05),與懷孕母豬的趨勢相似。育肥豬在試驗(yàn)期間抗體水平差異不顯著(P>0.05)。

注:柱狀圖內(nèi)數(shù)字為樣品數(shù)量,2022年第一季度由于場內(nèi)防控PEDV的要求,未對保育豬進(jìn)行采樣,此季度無數(shù)據(jù)。* :P<0.05;***:P<0.01。

3 討論

PED的流行一般有明顯的季節(jié)性,常在寒冷季節(jié)暴發(fā)[9],在其他季節(jié)則以零星、散發(fā)為特征。廣西地區(qū)全年溫度較高,豬場更注重防暑降溫,防寒保暖的措施不夠完善,冷應(yīng)激會使豬群免疫應(yīng)答能力下降。另外,由于母豬胎盤結(jié)構(gòu)特殊,母源抗體不能直接通過胎盤傳遞給仔豬,仔豬只能通過攝入初乳來獲得母源抗體,冷應(yīng)激時,新生仔豬的初乳攝入量明顯降低[10],獲得的母源抗體不能給仔豬提供良好保護(hù)。本研究豬場在2021年第四季度的Ct值均值最低,排毒量較大,且豬群在第四季度PED IgG抗體水平最低,這些成為導(dǎo)致豬場PED暴發(fā)的主要原因之一。

PEDV主要通過糞口傳播[4],對哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重,病死率高達(dá)80%～100%[11]。本研究豬場在2021年12月PED暴發(fā)期間,全場產(chǎn)房仔豬死亡率為20.79%。主要原因是,場內(nèi)第一時間采取了一系列防控措施,如暴發(fā)PED的棟舍專人飼養(yǎng)管理、發(fā)病仔豬及時安樂死并無害化處理、向水樣腹瀉物鋪灑干燥粉阻止PEDV通過氣溶膠傳播[12]、禁止沖洗糞便防止PEDV通過下水道傳播等。養(yǎng)殖場應(yīng)根據(jù)場內(nèi)自身的條件制定嚴(yán)格的生物安全管理制度來控制PEDV的傳播,有效的內(nèi)部生物安全制度能夠切斷PEDV在豬場內(nèi)的傳播[13]。

沙萬里等[14]發(fā)現(xiàn)自家組織滅活苗抗體平均水平高于商品疫苗,說明自家組織滅活苗對PED的防控有一定的效果。本研究中,對豬場自家組織滅活苗使用的病料組織進(jìn)行了RT-qPCR檢測,發(fā)現(xiàn)不同批次間的自家組織滅活苗病料組織的病毒含量差異大,推測這可能是本場自家組織滅活苗免疫效果不穩(wěn)定的原因之一。關(guān)于反飼,2022年對后備母豬進(jìn)行反飼馴化后,懷孕母豬群的PED IgG 抗體水平比2021年第四季度出現(xiàn)了明顯上升,而且對后備母豬反飼馴化后,產(chǎn)房仔豬的死亡率在2022年1月出現(xiàn)了明顯降低。李孝文等[15]研究發(fā)現(xiàn),后備母豬經(jīng)過PEDV馴化的豬場PED發(fā)病頻率、發(fā)病損失都相對較低,各項(xiàng)生產(chǎn)指標(biāo)相對更加優(yōu)良,這與本次的研究結(jié)果一致。

近年來,PED在我國的流行日趨嚴(yán)重,仔豬的高死亡率給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究發(fā)現(xiàn),通過建立完善的生物安全防控體系、對母豬群免疫自家組織滅活苗以及對后備母豬進(jìn)行反飼馴化,可以有效控制PED疫情的暴發(fā)和蔓延,具有重要的參考意義。