邵雪花　劉傳濱　匡石滋　賴多　劉傳和　賀涵　肖維強

摘要：利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對101份橄欖種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并繪制指紋圖譜。從96條ISSR引物中篩選出10條引物，對廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所橄欖資源圃和潮州市果樹所資源圃內(nèi)101份資源進(jìn)行分子標(biāo)記，使用UPGMA聚類分析橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性，從10對引物中挑選擴增條帶清晰、多態(tài)性好的核心引物進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建橄欖DNA指紋圖譜。分析結(jié)果顯示，10條ISSR引物對101份橄欖樣品進(jìn)行擴增，共得到136條條帶，其中多態(tài)性條帶135條，多態(tài)率為99.26%，平均每條引物擴增得到條帶13.60條，平均每條引物擴增得到多態(tài)性條帶13.50條，表明供試材料間遺傳多樣性較高。通過UPGMA聚類分析可知，101份橄欖種質(zhì)資源樣品間的遺傳相似性系數(shù)為0.58～0.97，表明品種間親緣關(guān)系較近。在遺傳相似性系數(shù)為0.68時，可將101份橄欖種質(zhì)資源分為5組，第1組包含種質(zhì)48份，第2組包含種質(zhì)45份，第3組包含種質(zhì)5份，第4組包含種質(zhì)2份，編號C74的大納甜橄欖單獨為第5組，說明該品種與其他樣品相比發(fā)生了明顯的遺傳變異。利用篩選得來的6條核心引物組合成功構(gòu)建了橄欖DNA指紋圖譜，為供試的101份橄欖品種編寫了一套唯一的指紋圖譜編碼。研究結(jié)果成功構(gòu)建了101份橄欖種質(zhì)的指紋圖譜，為橄欖種質(zhì)資源的挖掘、利用和創(chuàng)制新品種等提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：橄欖；ISSR分子標(biāo)記；指紋圖譜；種質(zhì)資源；遺傳多樣性

中圖分類號：S667.502.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0094-09

橄欖（Canarium album），橄欖科橄欖屬喬木，別稱黃欖、青果、橄欖子等，原產(chǎn)于我國南方，主要分布在我國福建省、廣東省、四川省、廣西壯族自治區(qū)、重慶市和浙江省等南部省份（市）和地區(qū)，尤以廣東省和福建省栽培最多［1］。橄欖是傳統(tǒng)的藥食同源水果，其味甘酸，性平，有清熱解毒、利咽化痰、除煩醒酒的功效［2］，其果實富含豐富的多酚類物質(zhì)［3-4］、黃酮類化合物［5］，可加工制成果酒、果汁、茶葉等［6-8］，還能用于抗病毒［9］、抗氧化［10-11］、保護(hù)肝臟［12］、提高免疫和調(diào)節(jié)血脂血糖［13］等方面。

目前，橄欖的新品種選育快速發(fā)展，由于不同地區(qū)的橄欖品種相互引種、雜交，導(dǎo)致了各個地區(qū)橄欖品種遺傳背景復(fù)雜，但目前品種鑒定工作大多依靠形態(tài)特征鑒別［14-16］，橄欖遺傳背景不明確、缺乏科學(xué)系統(tǒng)的檢測方法和權(quán)威的分類系統(tǒng)［17］，致使同名異物或同物異名的現(xiàn)象時常發(fā)生。ISSR是一種研究物種遺傳多樣性的常見方法，結(jié)合了RAPD和SSR 2種技術(shù)的優(yōu)點，具有不受環(huán)境影響、結(jié)合位點豐富和靈敏度準(zhǔn)確性高等特點，在品種鑒定方面，DNA分子標(biāo)記技術(shù)比傳統(tǒng)技術(shù)更加方便、快捷［17-18］。

李婷利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對福建莆田24份不同品種的枇杷葉進(jìn)行鑒定與分析，使用14條核心引物對其進(jìn)行擴增，共擴增出150條條帶，其中有79條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為 52.67%［19］。崔學(xué)強等利用ISSR技術(shù)對22種石斛蘭的親緣關(guān)系及遺傳多樣性進(jìn)行了分析，共擴增出241條條帶，其中有241條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例為100%，遺傳相似系數(shù)為0.70～0.88［20］。楊培奎等采用ISSR技術(shù)對粵東和潮汕地區(qū)的64個橄欖品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，粵東地區(qū)與潮汕地區(qū)的橄欖遺傳多樣性水平較低，且來源地與品種名關(guān)系不大［21］。賴瑞聯(lián)等通過ISSR和RAPD聯(lián)用技術(shù)對福建地區(qū)的86份橄欖資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)橄欖種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，且這種遺傳多樣性存在明顯的地域性差異［22］。陳海云等對云南的59份油橄欖進(jìn)行了ISSR鑒定分析，發(fā)現(xiàn)云南地區(qū)的橄欖資源同樣具有較高的遺傳多態(tài)性［23］。在種質(zhì)資源科學(xué)研究中，品種鑒定的原則是選用較少的引物區(qū)分較多的品種。

以上研究結(jié)果充分說明：（1）ISSR技術(shù)可有效鑒別出橄欖種質(zhì)資源的遺傳多樣性；（2）橄欖種質(zhì)資源的遺傳多樣性大多具有明顯的地區(qū)差異。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所橄欖資源圃從2010年開始大量收集國內(nèi)外橄欖種質(zhì)資源，包括瀕臨淘汰的地方品種及國內(nèi)外的主栽品種，目前已有資源60余份，而潮州市果樹研究所橄欖資源圃主要集中了廣東省內(nèi)的橄欖資源，為闡明這2個資源圃內(nèi)橄欖資源的同名異物或同物異名現(xiàn)象與品種間的遺傳分化和變異情況，本研究擬通過ISSR技術(shù)對廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所橄欖資源圃和潮州市果樹研究所橄欖資源圃中的101個橄欖品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期通過改善ISSR擴增條件篩選出核心引物，開發(fā)一種能夠運用在大規(guī)模樣本篩查且具備較高多態(tài)率的橄欖品種鑒定方法，并構(gòu)建分子指紋圖譜，為ISSR 分子標(biāo)記在橄欖分類方面的應(yīng)用提供借鑒，以期為橄欖資源的品種鑒定和種質(zhì)創(chuàng)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗方案

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果樹資源與環(huán)境實驗室進(jìn)行，于2021年9月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所和潮州市果樹研究所橄欖資源圃進(jìn)行供試101份橄欖樣品的采集（種質(zhì)資源品種信息見表1）。將采摘后的新鮮橄欖嫩葉迅速置于干冰中保存，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

使用北京聚合美生物科技公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取101份橄欖樣品的DNA［24］（2021年10月）。將提取的DNA樣品使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測其DNA純度，使用Nano Drop 2000分光光度計檢測DNA濃度，合格DNA樣品置于 -20 ℃ 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?5］。

1.2.2 ISSR分析

在加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的通用引物序列中篩選出10條多態(tài)性好、條帶清晰的引物對101份橄欖種質(zhì)資源的DNA樣品進(jìn)行擴增［26］（2021年12月至2022年2月）。PCR反應(yīng)總體系為30 μL，其中包含15 μL 2X Master Mix，1 μL引物（10 μmol/L），2 μL DNA模板，12 μL去離子水。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，50 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，于4 ℃保存［27］。

使用8 μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶，拍照并記錄［25］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用人工讀帶的方式統(tǒng)計擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)。將電泳圖譜上同一水平有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，以此構(gòu)建0、1數(shù)據(jù)矩陣［27］。通過NT-SYSpc 2.0軟件計算橄欖樣品間的親緣相似性系數(shù)，用以分析橄欖樣品間親緣性關(guān)系。使用UPGMA法制作聚類圖，繪制出101份橄欖樣品間的遺傳關(guān)系圖譜。利用POPGENE軟件對101份橄欖進(jìn)行遺傳多樣性分析，計算總擴增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)與多態(tài)率，根據(jù)以上數(shù)據(jù)構(gòu)建橄欖種質(zhì)的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴增多態(tài)性分析

使用從加拿大哥倫比亞大學(xué)設(shè)計的通用引物序列中篩選出的10條引物對48份橄欖樣品進(jìn)行擴增，部分?jǐn)U增圖譜見圖1-A、圖1-B。

由表2可見，10對引物總共擴增出136條條帶，其中有135條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為99.26%。平均每條引物擴增條帶數(shù)為13.6條，平均每條引物擴增得到多態(tài)性條帶13.5條。在10條引物中，有9條引物的多態(tài)率為100%，分別是UBC808、UBC812、UBC835、UBC836、UBC880、UBC884、UBC886、UBC888和UBC889。多態(tài)性最差的引物為UBC890，其多態(tài)率91.67%。引物擴增結(jié)果顯示，以上10條引物多態(tài)性豐富，其多態(tài)率均高于80%，均可用于后續(xù)遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建工作。

2.2 聚類結(jié)果

UPGMA聚類結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：101份供試橄欖種質(zhì)資源樣品間遺傳相似系數(shù)為0.58～0.97，平均遺傳相似系數(shù)為0.78，品種間有一定的遺傳差異。101份樣品中，品種C54烏欖與C55云旨1號遺傳距離最近， 遺傳系數(shù)為0.97。品種C56高州大坡02和C77東酸遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳系數(shù)為0.58，說明這2個品種遺傳分化程度高。

在遺傳系數(shù)0.68處，可將101份種質(zhì)資源分成5組。第1組包含種質(zhì)48份，編號為C1～C48。第2組包含種質(zhì)45份，編號為C49～C52、C54～C55、C57～C73、C75～C96。第3組包含種質(zhì)5份，編號為C97～C101。第4組包含種質(zhì)2份，編號為C53、C56。編號C74大納甜樣品單獨為第5組，說明該樣品與其他樣品相比，發(fā)生了明顯的遺傳變異。

2.3 橄欖DNA指紋圖譜構(gòu)建

本研究從表2所列的10條引物中篩選出了6條條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物用于橄欖DNA指紋圖譜的編寫，分別是UBC808、UBC835、UBC880、UBC886、UBC888、UBC890。選擇這6條引物中清晰、典型、多態(tài)性豐富的條帶進(jìn)行賦值，引物典型條帶賦值信息見表3。其中條帶UBC835-1 080 bp、UBC835-350 bp、UBC886-580 bp 與UBC888-550 bp為品種特征條帶，利用UBC835-350 bp這一位點或同時通過UBC835-1 080 bp、UBC886-580 bp與UBC888-550 bp這3個位點，可以鑒別出品種C74大納甜。

根據(jù)表3多態(tài)性條帶賦值標(biāo)準(zhǔn)對101份橄欖供試樣品進(jìn)行DNA指紋編碼，結(jié)果見表4。其中品種C7吶種的指紋編碼為23-1-2-345-—-15，表示該品種的PCR擴增產(chǎn)物在引物UBC808的1 100、750 bp處、引物UBC835的1 080 bp處、引物UBC880的680 bp處、引物UBC886的700、580、300 bp 處，引物UBC890的1 250、400 bp處均有條帶；在引物UBC888給予賦值的典型條帶位點無條帶。在品種C14長穗赤的指紋編碼為12-1-123-1345-2-123，表示該品種的PCR擴增產(chǎn)物在引物UBC808的1 250、1 100 bp處，在引物UBC835的1 080 bp處，在引物UBC880的750、680、625 bp處，在引物UBC886的1 250、700、580、300 bp處，引物UBC888的450 bp處，引物UBC890的1 250、700、660 bp處均有條帶。

6條引物中的每一條引物都不能單獨用以鑒定101份種質(zhì)，但將6條引物結(jié)合使用，便可以準(zhǔn)確、高效地鑒定所有種質(zhì)資源。圖3-A、圖3-B、圖 3-C、圖3-D為101份橄欖種質(zhì)資源DNA指紋編碼對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。通過圖3-A、圖3-B、圖3-C、圖3-D能夠更加清晰、直觀地看出101份橄欖種質(zhì)資源的多態(tài)性擴增情況，且每個品種都擁有一套唯一的指紋編碼。

3 討論與結(jié)論

ISSR 是一種利用微衛(wèi)星序列作為 PCR 引物來生成多位點標(biāo)記的技術(shù)［27］。目前，ISSR技術(shù)不僅已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種野生種與栽培品種的鑒定中［28-29］，還可應(yīng)用在常規(guī)表型分類以及細(xì)胞學(xué)分類的鑒定上［30］。近年來的研究表明，ISSR技術(shù)可有效鑒別出橄欖種質(zhì)資源的遺傳多樣性［31］，單獨運用ISSR技術(shù)擴增的多態(tài)性近90%［23］，ISSR和RAPD技術(shù)相結(jié)合擴增的多態(tài)性達(dá)95%［32］，多態(tài)性雖然較高， 但引物的需求量大或需借助其他技術(shù)手段進(jìn)行聯(lián)合分析，鑒定工作較復(fù)雜。在種質(zhì)資源科學(xué)研究中，品種鑒定的原則是選用較少的引物區(qū)分較多的品種。本研究從96條ISSR多態(tài)性引物中篩選出10條核心引物用于101份橄欖種質(zhì)親緣關(guān)系、遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建，10條核心引物擴增的多態(tài)率為99.26%，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，最少可利用3對（UBC808、UBC835和UBC886）多態(tài)性引物即可全部區(qū)分101份橄欖資源。

通過UPGMA聚類分析橄欖種質(zhì)資源的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，供試的橄欖種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性，且品種間存在較豐富的遺傳變異，在遺傳系數(shù)0.68處，可將101份種質(zhì)資源分成5組。第1組包含種質(zhì)48份，編號為C1～C48。第2組包含種質(zhì)45份，編號為C49～C52、C54～C55、C57～C73、C75～C96。第3組包含種質(zhì)5份，編號為C97～C101。第4組包含種質(zhì)2份，編號為C53、C56。編號C74的大納甜樣品單獨為第5組。說明供試的橄欖品種之間沒有地域性差異，相同出處、相似命名的品種間親緣關(guān)系并不一定最近，如思賀香欖1號和思賀香欖2號、高山大坡01和高山大坡02，這一現(xiàn)象也與前人的研究結(jié)果相吻合［17，21，33］。親緣關(guān)系揭示，同一資源圃的橄欖樣品遺傳相似性較高，這可能是因為材料的來源地相對集中，品種存在交叉引種或不同嫁接組合導(dǎo)致；命名相似的品種并不一定聚為一類，這也許是在常年定向選育中，由于不同的實生母樹通過嫁接繁衍，出現(xiàn)了某些果實形態(tài)特征相似，從而使用了相近的命名，如思賀香欖1號和思賀香欖2號。受橄欖品種資源限制和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)習(xí)慣、技術(shù)的影響，在品種選育上具有一定的盲目性和隨意性，因而出現(xiàn)了品種遺傳背景混亂的現(xiàn)象。

本研究利用了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所和潮州市果樹研究所的101份橄欖種質(zhì)資源進(jìn)行了品種鑒定與分析，通過分子標(biāo)記技術(shù)建立了橄欖種質(zhì)資源的指紋圖譜，為品種資源編寫了一套獨一無二的“分子身份證”，可避免重復(fù)性的收集和保存，剔除同名異物和同物異名的橄欖種質(zhì)資源，為橄欖的分子育種提供理論依據(jù)。

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收稿日期：2022-04-19

基金項目：廣東省科技廳駐鎮(zhèn)幫鎮(zhèn)扶村農(nóng)村科技特別員項目（編號：KTP20210112）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院汕尾分院科技合作專項（編號：2020汕尾分院專項-02）；廣東省優(yōu)稀水果現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（編號：2019KJ116）；廣東省潮州市重大科技專項（編號：20210106）。

作者簡介：邵雪花（1983—），女，寧夏石嘴山人，博士，助理研究員，主要從事果樹栽培與新品種育種研究。E-mail：sxh19831017@163.com。

通信作者：肖維強，碩士，副研究員，主要從事果樹栽培與新品種育種研究。E-mail： xwq6817@126.com。