張洋洋，劉 聰，王嘉一

（邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽 422000）

藍(lán)莓是杜鵑花科越橘屬多年生低灌木類植物，果實(shí)中富含花青素和維生素C 等多種抗氧化成份[1]，具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎癥、抗癌、保護(hù)心臟和軟化血管等功能[2]，因營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者喜愛。

即食果蔬是新鮮蔬菜和水果經(jīng)清洗、修整、鮮切、殺菌、拼盤和包裝等加工工序，消費(fèi)者拆封即食的一種產(chǎn)品[3]。該類產(chǎn)品必須經(jīng)過殺菌清洗，以減少表面微生物數(shù)量。超聲波是一種物理非熱殺菌技術(shù)，頻率大于20 kHz時(shí)能引起空化作用以及力學(xué)、熱學(xué)和化學(xué)效應(yīng)，破壞微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)[4-5]。Limaye 等[6]使用1、3 MHz 超聲波處理大腸桿菌和沙門氏菌，4 min 可滅活95.5%大腸桿菌，11.5 min可滅活95.5%沙門氏菌。此外，超聲還能去除果蔬表面泥沙和污垢，是一種非化學(xué)去污手段，符合當(dāng)下綠色環(huán)保的理念。許多研究也表明，柵欄技術(shù)殺菌效率高于單一消毒方法[7]。Johnson 等[8]發(fā)現(xiàn)超聲可以增強(qiáng)抗生素對生物膜的清除效果，70 kHz 超聲與慶大霉素聯(lián)合處理2 h 能清除97%大腸桿菌生物膜；與紅霉素結(jié)合后殺菌效果優(yōu)于單一紅霉素處理。Park 等[9]發(fā)現(xiàn)0.15%富馬酸聯(lián)合40 kHz超聲，可顯著降低蘋果汁中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，優(yōu)于單一消毒方法。

鮮切清洗過程中普遍使用含氯消毒劑來滅活表面微生物，但清洗水會(huì)導(dǎo)致交叉污染。因此，對清洗水中微生物滅活效果分析已引起學(xué)界重視。Haute 等[10]發(fā)現(xiàn)5 mg/L二氧化氯能完全滅殺水中的細(xì)菌、霉菌、酵母以及大腸桿菌；Gómez-López 等[11]發(fā)現(xiàn)7 mg/L 自由氯能有效滅殺清洗水中的大腸桿菌。此外，大量實(shí)踐研究表明低濃度氯（10 mg/L 自由氯）對果蔬的殺菌效果與100～200 mg/L自由氯無顯著性差異。因此，采用低頻超聲結(jié)合低濃度氯的方法既能有效控制成本，又能去污。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該組合能有效滅活藍(lán)莓表面細(xì)菌、霉菌和酵母，且不對品質(zhì)造成影響[12]，但作用機(jī)制卻不明確。本研究采用測序技術(shù)分析了藍(lán)莓貯藏過程（0～5 d、4 ℃）中細(xì)菌和真菌的多樣性，以期從微生態(tài)角度對其作用機(jī)制予以解釋。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

次氯酸鈉、氫氧化鈉、甲醇、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、鹽酸、乙酸鈉、醋酸鈉、三氯乙酸，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

超聲清洗機(jī)，28 kHz,潔盟清洗設(shè)備有限公司；液氮研磨機(jī)，A11,艾卡儀器設(shè)備有限公司；渦旋振蕩器，VM-500Pro,群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH 計(jì)，PHS-3E，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)，NanoDrop NC200，Thermo Fisher Scientific,美國。

1.2 殺菌處理

新鮮藍(lán)莓于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天購自邵陽湘西南水果批發(fā)市場。使用藍(lán)莓勻漿制備洗滌水，化學(xué)需氧量調(diào)節(jié)至（250±10）mg/L，自由氯濃度調(diào)至10 mg/L。低濃度氯用次氯酸鈉配制而成，清水為實(shí)驗(yàn)室自來水。超聲參數(shù)為28 kHz和400 W，清洗3 min。第0 天清水處理組為CK0，超聲結(jié)合低濃度氯處理組為T0；4 ℃貯藏第5 天，清水處理組為CK5，超聲結(jié)合低濃度氯處理組為T5。

1.3 樣本DNA 采集

將藍(lán)莓表面微生物震蕩至生理鹽水中，使用滅菌的0.22 μm 濾膜截留細(xì)菌，隨后裝入無菌離心管中，并置于-80 ℃凍存待用。使用DNA 提取試劑盒（MP Biomedicals，美國）對濾膜上全DNA 進(jìn)行提取，得到的DNA 使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。質(zhì)量合格后將提取得到的DNA 在干冰條件下，進(jìn)行送樣分析?？紤]到為環(huán)境樣本，樣本間差異較大，故共進(jìn)行5 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 擴(kuò)增與測序

對所提取DNA 的16S rRNA 中V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[13]，前引物名稱為338F，前引物序列為ACTCCTACGG GAGGCAGCA，后引物名稱為806R，后引物序列為GGACTACHVGGGTWTCTAAT，擴(kuò)增片段長度480 bp；對提取的DNA 的ITS 進(jìn)行擴(kuò)增，前引物名稱為ITS5F，前引物序列為GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，后引物名稱為ITS1R，后引物序列為GCTGCGTTCTTCATCGATGC，擴(kuò)增片段長度250 bp。將真菌和細(xì)菌的PCR 產(chǎn)物送上海派森諾基因公司進(jìn)行測序分析。

1.5 測序生物信息學(xué)分析

基于Illumina MiSeq 進(jìn)行生物信息學(xué)分析。按照DADA2 方法[14]進(jìn)行序列去噪，對各樣本組在不同物種分類學(xué)水平的具體組成進(jìn)行展示。根據(jù)特征序列（operational taxonomic unit，OTU）在不同樣本中的分布，評估每個(gè)樣本的Alpha 多樣性水平，并通過稀疏曲線反映測序深度是否合適。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列處理分析

稀疏曲線可反映樣本測序深度。如圖1 所示，曲線越平緩，表明測序數(shù)據(jù)量已足夠，繼續(xù)增加測序深度也無法檢測到新的OTU。隨著抽取序列的增加，真菌稀疏曲線在40 000 次時(shí)趨于平穩(wěn)（圖1A），細(xì)菌稀疏曲線在30 000 次時(shí)趨于平穩(wěn)（圖1B），說明測序量足以涵蓋樣品中的所有分類群。根據(jù)序列信息統(tǒng)計(jì)表（表1）結(jié)果顯示，所有樣本的輸入（原始數(shù)據(jù)量）、過濾和降噪（有效序列量）數(shù)值接近，且單個(gè)重復(fù)樣本測序通量均在九萬條以上，足夠全面反映樣本的微生物多樣性與群落組成狀況。

表1 序列處理統(tǒng)計(jì)表Table 1 Sequence processing statistics

2.2 OTU 聚類分析

藍(lán)莓表面真菌維恩圖CVE 如圖2A（見下頁）所示，CK0、T0、CK5、T5 組的OTU 數(shù)量分別為110、166、180 和91 個(gè)，其中78 個(gè)OTU 為4 組共有。處理組貯藏5 d 后OTU 數(shù)量減少75，而對照增加70。藍(lán)莓表面細(xì)菌Veen圖見圖2B，CK0、T0、CK5、T5 組的OTU 數(shù)量分別為5 761、2 510、3 522 和5 864 個(gè)，其中383 個(gè)OTU 為4 組共有。貯藏后處理組細(xì)菌OTU 數(shù)量增加3 354，而對照組減少2 239，與真菌觀察結(jié)果相反。

圖2 藍(lán)莓表面真菌（A）和細(xì)菌（B）OTU 數(shù)量Veen 圖Fig.2 Veen chart of OTU number of fungi (A) and baterial(B) present on blueberry

2.3 主坐標(biāo)（principal co-ordinates analysis，PCoA）分析

使用距離矩陣（Bray-Curtis 距離）并結(jié)合主坐標(biāo)分析將樣本差異在低維度進(jìn)行展示，以分析樣本差異數(shù)據(jù)（距離矩陣）的比例。點(diǎn)距離越近表示在相應(yīng)維度中的功能組成越相似[15]。真菌菌群結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析如圖3A 所示，真菌PC1 和PC2 主成分方差貢獻(xiàn)率分別為57.4%和11.9%，表明處理組與對照組之間功能組成存在差異，貯藏5 d 后二者差異更為明顯。而T5 組距離與T0 組距離較近，表明處理組在第5 天時(shí)與對照組功能組成無明顯差異。細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析如圖3B 所示，PC1 和PC2 兩個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率分別為57.2%和15.4%。T5組距離與T0 組距離明顯，表明處理組在第5 天時(shí)與對照組功能組成存在差異。

圖3 藍(lán)莓表面真菌（A）和細(xì)菌（B）菌群結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis of fungi (A) and bacterial (B) community of blueberry

2.4 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性反映微生物物種豐富度與多樣性，Chao1 指數(shù)表征豐富度，Shannon 和Simpson 指數(shù)表征多樣性[16]。圖4A 顯示處理組與對照組中真菌Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無明顯差異（P＞0.05），說明超聲結(jié)合低濃度氯處理對藍(lán)莓表面真菌菌落豐富度與多樣性沒有造成顯著影響。圖4B 表明T0 與T5 組Chao1 指數(shù)存在顯著差異，處理組第5 天細(xì)菌豐富度顯著高于處理組第0 天，而Shannon 和Simpson 指數(shù)均無明顯差異，說明處理組在貯藏過程中細(xì)菌菌落豐富度顯著增加而多樣性無明顯變化。

圖4 藍(lán)莓表面真菌（A）和細(xì)菌（B）Alpha 多樣性指數(shù)圖Fig.4 Alpha diversity index of fungi (A) and bacterial (B) on blueberry

2.5 真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

藍(lán)莓表面真菌的門水平分布如圖5A 所示，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是優(yōu)勢菌門。部分子囊菌門可引起食品霉變和植物病變[17]。銹菌和黑粉菌等擔(dān)子菌能導(dǎo)致嚴(yán)重的植物病害[18]。藍(lán)莓表面子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度為82.50%和8.81%，處理后變?yōu)闉?3.67%和19.77%，說明該處理可能對子囊菌門滅活效果更為明顯，使其相對豐度降低8.83%，而對擔(dān)子菌門滅活效果較差，使其相對豐度升高10.96%。貯藏5 d后，對比T0 和T5 組，子囊菌門相對豐度在菌群中占比接近，說明處理組在貯藏期間子囊菌門相對豐度穩(wěn)定，維持了較穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)。

圖5 門（A）和屬（B）水平真菌相對豐度分布圖Fig.5 Relative abundance of fungi at phylum (A) and genus (B) level

以屬等較高等級分類單元作為多樣性的測量單位，能夠較好地反映一個(gè)特定群落的生物多樣性特征。藍(lán)莓表面真菌屬水平分布如圖5B 所示，CK0 組的優(yōu)勢真菌屬是曲霉屬（Aspergillus）、赤霉屬（Gibberella）、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、木耳屬（Auricularia）和畢赤屬（Pichia），分別占13.69%、6.80%、6.00%、4.45%和4.09%；T0 組的優(yōu)勢真菌屬是木耳屬、曲霉屬、畢赤屬、嗜熱鏈球菌屬（Mycothermus）和馬拉色菌屬（Malassezia），分別占13.49%、7.64%、6.91%、4.40%和3.22%。

在第0 天，殺菌處理使曲霉屬、赤霉屬和圓孢霉屬相對豐度分別下降6.05%、6.36%和4.29%。曲霉屬和圓孢霉屬會(huì)引起果蔬腐敗變質(zhì)。赤霉屬則大多是植物病源真菌[19]。說明該處理對曲霉屬、赤霉屬和圓孢霉屬滅殺效果明顯，使其相對豐度降低，而對木耳屬和畢赤屬滅殺效果較差，使其相對豐度上漲了9.06%和2.82%，進(jìn)而解釋了前期研究中發(fā)現(xiàn)的處理組中霉菌酵母計(jì)數(shù)在第0天低于對照組。

CK5 組的優(yōu)勢菌屬是隱匿性菌屬（Occultifur）、馬拉色菌屬、曲霉菌屬、木耳屬和哈薩克斯坦菌屬（Kazachstania），分別占10.41%、9.07%、8.54%、6.22%和5.13%；T5 組的優(yōu)勢菌屬是嗜熱鏈球菌屬、木耳屬、哈薩克斯坦菌屬、畢赤屬和曲霉菌屬，分別占14.28%、5.51%、5.50%、4.31%和2.75%。T5 組與T0 組比較，T5 組中嗜熱鏈球菌屬相對豐度上漲了9.88%。說明在第5 天，處理組通過降低其他菌屬的相對豐度提高嗜熱鏈球菌屬的相對豐度，使藍(lán)莓表面霉菌酵母計(jì)數(shù)低于對照組。

2.6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

藍(lán)莓表面細(xì)菌門水平分布如圖6A 所示，變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠灣菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）和浮霉菌門（Planctomycetes）是藍(lán)莓表面的優(yōu)勢菌門，CK0 組中相對豐度分別為47.00%、19.38%、8.50%、8.14%和5.57%；T0組中相對豐度分別為46.97%、18.13%、9.34%、8.17%和8.08%；CK5 組中相對豐度分別為46.02%、20.63%、8.75%、8.30%和8.28%；T5 組中相對豐度分別為40.85%、31.70%、4.89%、7.83%和6.02%。變形桿菌在果蔬表面微生物群落組成中占比較高，其中不乏一些食源性致病菌，如沙門氏菌和大腸桿菌。

圖6 門（A）和屬（B）水平細(xì)菌相對豐度組成圖Fig.6 Relative abundance of bacterial at phylum (A) and genus (B) level

藍(lán)莓表面細(xì)菌屬水平分布如圖6B 所示，羅爾斯頓尼亞菌屬（Ralstonia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和乳桿菌屬（Lactobacillus）是藍(lán)莓表面屬水平優(yōu)勢菌屬。羅爾斯頓尼亞菌屬能導(dǎo)致番茄、煙草、桑樹等植物枯萎死亡，俗稱“青枯病”[20]，是典型的土傳病害，可在土壤、水體中存活長達(dá)5 年以上，防控難度極大[21]。鞘氨醇單胞菌屬具有高效的代謝調(diào)控和基因調(diào)控能力，在促進(jìn)植物生長等方面具有應(yīng)用潛力[22]。乳桿菌屬能夠產(chǎn)生苯乳酸，具有防治果蔬真菌病害的作用[23]。羅爾斯頓尼亞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和乳桿菌屬在CK0 組中的占比分別為20.66%、12.45%和5.39%，在T0 組中占比分別為20.23%、11.20%和7.81%，其相對豐度未發(fā)生明顯變化。T5 組中三類菌屬分別占18.50%、9.11%和10.23%。T5 與T0 對比發(fā)現(xiàn)，三類菌屬相對豐度未發(fā)生明顯變化，說明殺菌處理可能對三種微生物滅活效果一致，使藍(lán)莓表面細(xì)菌組成保持在穩(wěn)定水平，使殺菌處理后較低的菌落總數(shù)一直保持到貯藏末期，解釋了前期研究觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即處理組中菌落總數(shù)在0～5 d 一直低于對照組。

3 結(jié)論

為明晰超聲結(jié)合低濃度氯對藍(lán)莓天然菌群滅殺作用機(jī)理，本研究從微生態(tài)視角進(jìn)行了分析，研究結(jié)論主要有：藍(lán)莓表面優(yōu)勢細(xì)菌為羅爾斯頓尼亞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、乳桿菌屬，殺菌處理對三種細(xì)菌相對豐度未產(chǎn)生影響；優(yōu)勢真菌為曲霉屬、赤霉屬、圓孢霉屬、木耳屬、畢赤屬，殺菌處理后曲霉屬相對豐度下降最明顯，木耳屬相對豐度升高最明顯，嗜熱鏈球菌屬成為優(yōu)勢菌屬；嗜熱鏈球菌屬在貯藏末期相對豐度最大，該菌可能通過抑制其它真菌生長以使處理組中霉菌酵母計(jì)數(shù)結(jié)果低于對照組。本研究也存在一定局限性，如測序深度問題，在未來的研究中將進(jìn)一步采用宏基因組測序?yàn)榫汗δ芎头N水平變化提供深度解析。