董勝君，范雯萱，張云程，王蓬鍇，陳建華，李 彪

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽 110161；2.遼寧省喀左縣林業(yè)種苗管理站，遼寧 喀左 122300）

植物花色不僅是觀賞植物的重要品質(zhì)特征，同時也是鑒定與區(qū)分不同花品種的重要指標(biāo)之一[1]?；ǘ湓陂_放過程中的色彩變化是由多種因子共同作用、相互影響的結(jié)果[2]，較多研究雖對花色變化與內(nèi)在機制進行了報道，但不同植物或同種植物的不同花色品種內(nèi)在機制變化差異較大，多種差異導(dǎo)致了花色多樣性，而最重要的影響因子為花瓣中的色素種類和含量[3-5]。植物體內(nèi)主要包含的色素種類有類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜堿。類胡蘿卜素可使花瓣呈黃色、橙色等顏色[6]，甜菜堿可使花瓣呈紅色或黃色[7]。類黃酮是一種重要的參與植物發(fā)育的次生代謝產(chǎn)物，其中花青素作為類黃酮產(chǎn)生的化合物之一，可為植物提供紅色、藍色、紫色等多種顏色[8]，花青素的甲基化、糖基化和?；紩够ㄉl(fā)生變化[7]。外界環(huán)境同樣會對花青素的合成產(chǎn)生影響，如溫度可通過影響與花青素合成相關(guān)的酶活性間接影響其合成，光照會通過光質(zhì)、光照度和光照時間影響花青素的生物合成等[9]，進一步影響花瓣呈色。目前對于花瓣色素種類和含量的研究已在木槿[10]、紫花含笑[11]、睡蓮[12]等植物中展開，對于粉花西伯利亞杏花色形成及調(diào)控機理探究尚未見報道。

西伯利亞杏（Prunus sibirica）為薔薇科杏屬喬木或灌木，多分布于我國東北及華北各省。其樹形優(yōu)美，喜光，根系發(fā)達，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應(yīng)性強等特點，不僅是保持水土、防風(fēng)固沙的優(yōu)良生態(tài)樹種，還具有較高的經(jīng)濟價值[13]。西伯利亞杏初春開花，花色多為白色或粉白色，鮮有粉色。本研究所選育出的特異種質(zhì)因其盛開時花瓣粉紅、花瓣數(shù)5～10 枚不等、花萼色澤對比普通西伯利亞杏更深而更具觀賞價值[14-15]，可作為我國東北及華北地區(qū)的觀賞性植物。目前關(guān)于西伯利亞杏花的研究多集中于表型及變異分析[16]、開花基因調(diào)控[17-18]以及嫁接繁殖技術(shù)上[15]。本研究以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)山杏國家林木種質(zhì)資源保存庫的粉花西伯利亞杏為研究對象，以白花西伯利亞杏為對照材料，對開花過程中的花色參數(shù)、細胞液pH 值、色素指標(biāo)及生理指標(biāo)進行測定和分析，以探究粉花西伯利亞杏呈色機理，為花色變異的品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以粉花西伯利亞杏花瓣為供試材料，以白花西伯利亞杏花瓣為對照，各材料均選自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)山杏國家林木種質(zhì)資源保存庫（東經(jīng)119°24′54″～120°23′24″，北緯40°47′12″～41°33′53″），樣木樹齡6～7 a。選擇3 株長勢一致、生長健壯且無病蟲害的樣木，于花后1 d（花芽頂端綻開露粉或露白）、11 d（花瓣呈氣球狀且即將展開）、15 d（花瓣全部展開）和19 d（花瓣萎蔫即將凋落）進行4次取樣（圖1），于8∶30-10∶30在每株樣木的東、西、南、北4 個方向分別選擇標(biāo)準(zhǔn)枝，每個標(biāo)準(zhǔn)枝選擇50～60 朵花。同一株樣木的花瓣采集完裝入錫紙包好，標(biāo)注日期及樣本編號后馬上投入到液氮罐中，帶回實驗室后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存待測。

圖1 西伯利亞杏開花過程中的形態(tài)及花色Figure 1 Morphology and flower color during anthesis of Prunus sibirica

1.2 測定項目及方法

1.2.1 花色參數(shù)測定方法 選取新鮮花瓣將其平鋪于白紙上，放置在室內(nèi)自然光源下，利用CR-10PLUS型色差儀進行測色。對花瓣明度L*值、紅度a*值和黃度b*值進行測定，再利用公式C*=（a*2+b*2）1/2，h=arctan(b*/a*)獲得彩度C*值和色相角h。每個樣品均進行3次生物學(xué)重復(fù)，最終數(shù)值取平均數(shù)。

1.2.2 細胞液pH值測定方法 參考唐前瑞等[19]的方法測定花瓣細胞液pH值，并略有改動。取0.5 g新鮮花瓣放入研缽中，加入2 mL蒸餾水研磨至勻漿，用PHS-3E型pH計測定勻漿pH值，用勻漿pH值代替花瓣細胞液pH值。每個樣品均進行3次生物學(xué)重復(fù)，最終數(shù)值取平均數(shù)。

1.2.3 色素含量測定方法 類黃酮含量的提取與測定采用Flavonoid Kit比色試劑盒法（南京建成生物工程研究所）；花青素含量的提取與測定參照余秋岫[11]的方法；類胡蘿卜素及葉綠素的提取與測定采用乙醇浸提法[21]。

1.2.4 生理指標(biāo)測定方法 可溶性糖含量的提取與測定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量的提取與測定采用考馬斯亮藍G-250染色法；脯氨酸含量的提取與測定采用茚三酮法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍四唑還原法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚比色法；過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外分光光度法[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理與分析，結(jié)合獨立樣本t檢驗法進行顯著性差異分析，各指標(biāo)間進行相關(guān)性分析和逐步回歸分析，采用Origin 2021繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉花西伯利亞杏花瓣花色參數(shù)變化

CIELAB標(biāo)準(zhǔn)色度系統(tǒng)可以較為客觀和科學(xué)地描述花瓣顏色。由表1可知，在開花過程中粉花西伯利亞杏花瓣的L*值呈先升高后降低趨勢，a*值和C*值呈先降低后升高趨勢，b*值和h值呈持續(xù)上升趨勢。L*值代表花色明暗程度，粉花花瓣在花后15 d 達到了明度最大值，白花西伯利亞杏花瓣則在花后11 d 達到最大值。a*值代表花色紅綠程度，數(shù)值越大，花色越趨于紅色。粉花花瓣a*值為正，白花花瓣a*值為負，二者均在花后1 d達到最大值。b*值代表花色黃藍程度，數(shù)值越大，花色越趨于黃色。粉花與白花花瓣開花過程中的b*值最大值均出現(xiàn)在花后19 d。h值變化趨勢有所差異，粉花花瓣h值變化呈“持續(xù)上升”趨勢，白花花瓣則呈“先升高后降低”趨勢。粉花花瓣的L*值在花后11 d和15 d均極顯著低于白花花瓣，在花后1 d和19 d均顯著低于白花花瓣；a*值始終極顯著高于白花花瓣；b*值在花后11 d和15 d均極顯著低于白花花瓣，在花后1 d和19 d均顯著低于白花花瓣；C*值在花后1 d極顯著高于白花花瓣，在花后11 d顯著高于白花花瓣。在花后15 d極顯著低于白花花瓣，在花后19 d顯著低于白花花瓣；h值始終極顯著高于白花花瓣。

表1 西伯利亞杏不同時期花瓣花色參數(shù)Table 1 Petal color parameters of Prunus sibirica at different periods

2.2 粉花西伯利亞杏花瓣細胞液pH值變化

細胞液pH 值大小是花瓣呈色穩(wěn)定與否的重要因素。由圖2可知，粉花西伯利亞杏在開花過程中花瓣細胞液pH 值處于酸性范圍內(nèi)，呈逐漸上升趨勢，在花后19 d 達到最大值。粉花花瓣細胞液pH 值為5.14～5.45，白花西伯利亞杏花瓣細胞液pH 值為5.28～6.16。二者比較，在花后11 d 和19 d 粉花花瓣的細胞液pH 值均極顯著低于白花花瓣，花后1 d 和15 d 顯著低于白花花瓣。

圖2 不同時期花瓣細胞液pH值Figure 2 pH values of petal cell fluid at different periods

2.3 粉花西伯利亞杏花瓣色素含量變化

花瓣呈色的根本原因是植物細胞中存在特定色素，其種類和含量共同影響花瓣的最終顏色。由圖3可知，粉花西伯利亞杏花瓣內(nèi)類黃酮含量變化呈逐漸下降趨勢，花后19 d 粉花花瓣和白花西伯利亞杏花瓣類黃酮含量比花后1 d 分別下降64.23%和80.23%。4個時期粉花花瓣內(nèi)類黃酮含量均極顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的2.04，1.50，2.05，3.70倍。

圖3 不同時期花瓣內(nèi)類黃酮含量Figure 3 Flavonoid contents in petals at different periods

由圖4可知，粉花花瓣內(nèi)花青素含量均呈先升高后降低趨勢，粉花花瓣和白花花瓣的花青素含量均在花后11 d達到峰值，與花后1 d相比上升幅度分別為25.84%和370.44%。粉花花瓣內(nèi)花青素含量在4個時期均極顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的36.92，9.88，8.80，4.34倍。

圖4 不同時期花瓣內(nèi)花青素含量Figure 4 Anthocyanin contents in petals at different periods

由圖5可知，粉花花瓣內(nèi)類胡蘿卜素含量均呈逐漸下降趨勢，花后19 d粉花花瓣和白花花瓣類胡蘿卜素含量比花后1 d分別下降77.33%和70.51%。粉花花瓣內(nèi)類胡蘿卜素含量在花后1 d和15 d均極顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的1.44 和1.86 倍，花后11 d 顯著高于白花花瓣，是其含量的1.34 倍，花后19 d 二者含量無顯著差異。

圖5 不同時期花瓣內(nèi)類胡蘿卜素含量Figure 5 Carotenoid contents in petals at different periods

由圖6可知，粉花花瓣內(nèi)葉綠素含量均呈先升高后降低趨勢，粉花花瓣和白花花瓣葉綠素含量分別在花后11 d和15 d達到峰值，與花后1 d相比上升幅度分別為311.36%和193.33%。粉花花瓣葉綠素含量在花后1 d和11 d 均極顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的1.47 和2.35 倍，在花后15 d 和19 d 同樣高于白花花瓣，但此時二者含量無顯著差異。

圖6 不同時期花瓣內(nèi)葉綠素含量Figure 6 Chlorophyll contents in petals at different periods

2.4 粉花西伯利亞杏花瓣內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸為植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與植物體內(nèi)的各種生命代謝活動，直接或間接地影響著花色苷的合成，對植物花瓣的花色形成起促進作用。由圖7可知，在開花過程中粉花西伯利亞杏花瓣內(nèi)可溶性糖含量呈先升高后降低趨勢，粉花花瓣和白花西伯利亞杏花瓣可溶性糖含量分別在花后11 d和15 d 達到峰值，與花后1 d 相比上升幅度分別為7.07%和4.50%。粉花花瓣內(nèi)可溶性糖含量在花后11 d 和15 d均極顯著高于白花花瓣，在花后1 d顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的1.06，1.10，1.06倍；僅在花后19 d低于白花花瓣，此時二者含量無顯著差異。

圖7 不同時期花瓣內(nèi)可溶性糖含量Figure 7 Soluble sugar contents in petals at different periods

由圖8可知，二者可溶性蛋白含量變化趨勢有所不同。粉花花瓣內(nèi)可溶性蛋白含量呈先降低后升高趨勢，于花后11 d降至最小值，為4.85 mg·g-1，之后含量迅速增加，在花后19 d比花后11 d高92.16%。白花花瓣則呈先升高后降低趨勢，前兩個時期可溶性蛋白增長緩慢，在花后15 d 迅速增長至29.04 mg·g-1，比花后1 d 高135.71%。粉花花瓣內(nèi)可溶性蛋白含量始終極顯著低于白花花瓣，分別是白花花瓣的48.86%、37.54%、23.42%和36.79%。

圖8 不同時期花瓣內(nèi)可溶性蛋白含量Figure 8 Soluble protein contents in petals at different periods

由圖9 可知，粉花花瓣內(nèi)脯氨酸含量呈先升高后降低趨勢，在花后15 d 達到峰值，粉花花瓣和白花花瓣脯氨酸含量分別比花后1 d 高231.88%和217.67%。粉花花瓣內(nèi)脯氨酸含量在4 個時期均極顯著低于白花花瓣，分別是白花花瓣的82.35%、68.47%、86.04%和66.07%。

圖9 不同時期花瓣內(nèi)脯氨酸含量Figure 9 Proline contents in petals at different periods

2.5 粉花西伯利亞杏花瓣內(nèi)保護酶活性變化

保護酶可清除花瓣中的活性氧自由基，對花色呈色及變化具有重要作用。由圖10 可知，在開花過程中粉花西伯利亞杏花瓣內(nèi)SOD酶活性呈先升高后降低趨勢，在花后15 d達到峰值。粉花和白花西伯利亞杏花后15 d花瓣內(nèi)的SOD 酶活性與花后1 d相比增長幅度分別為66.77%和76.98%。粉花花瓣內(nèi)SOD 酶活性在花后11 d和19 d 均極顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的1.29 和1.39 倍，在花后1 d 和15 d 均顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的1.16和1.10倍。

圖10 不同時期花瓣內(nèi)SOD酶活性Figure 10 SOD activity in petals at different periods

由圖11 可知，粉花花瓣內(nèi)POD 酶活性呈持續(xù)升高趨勢，在花后19 d 達到最大值。粉花和白花花后19 d 花瓣內(nèi)的POD 酶活性與花后1 d 相比增長幅度分別為343.76%和550.00%。前3 個時期粉花花瓣內(nèi)POD 酶活性均極顯著高于白花花瓣，分別是白花花瓣的1.44，1.83，1.50 倍，但花后19 d 低于白花花瓣，此時二者POD 酶活性無顯著差異。

圖11 不同時期花瓣內(nèi)POD酶活性Figure 11 POD activity in petals at different periods

由圖12 可知，粉花花瓣內(nèi)CAT 酶活性變化呈持續(xù)升高趨勢，在花后19 d 達到最大值。花后19 d 粉花和白花花瓣內(nèi)CAT 酶活性與花后1 d 相比增長幅度分別為62.69%和40.61%。各時期粉花花瓣內(nèi)CAT 酶活性均極顯著高于白花花瓣?；ê? d 二者CAT 酶活性均最低，粉花花瓣為白花花瓣的2.38 倍，至花后19 d 升至最高，粉花花瓣為白花花瓣的2.76倍。

圖12 不同時期花瓣內(nèi)CAT酶活性Figure 12 CAT activity in petals at different periods

2.6 粉花西伯利亞杏花瓣花色參數(shù)與各指標(biāo)的相關(guān)分析

由表2可知，粉花西伯利亞杏花瓣L*值與a*值呈顯著負相關(guān)，與b*值無顯著相關(guān)。L*值與C*值、類黃酮含量呈極顯著負相關(guān)，與類胡蘿卜素含量呈顯著負相關(guān)；與SOD 酶活性、脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)，與POD 酶活性、葉綠素含量呈顯著正相關(guān)。a*值與CAT 酶活性、SOD 酶活性、POD 酶活性、脯氨酸含量呈極顯著負相關(guān)，與b*值、色相角h、細胞液pH 值、可溶性蛋白含量呈顯著負相關(guān)；與C*值、類黃酮含量、類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(guān)，與花青素含量呈顯著正相關(guān)。由此可見類黃酮含量、類胡蘿卜素和花青素含量的增加會提高粉花花瓣的紅度值，使其顏色更粉，與此同時明度值隨之降低，花色深沉；反之細胞液pH 值、CAT 酶活性、SOD 酶活性、POD酶活性、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量的增長會使花色紅度值降低，而花色明度值提高。b*值與花青素含量、類胡蘿卜素含量、可溶性糖含量呈極顯著負相關(guān)，與類黃酮含量呈顯著負相關(guān)；與5項指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)，分別為色相角h值、細胞液pH值、可溶性蛋白含量、CAT酶活性和POD酶活性。

表2 粉花西伯利亞杏花瓣各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients among the indicators of Prunus sibirica pink flower petals

2.7 粉花西伯利亞杏花瓣花色參數(shù)與各指標(biāo)的逐步回歸分析

在上述相關(guān)分析中，較多因素與花色均具有顯著相關(guān)性，因此將進一步從各指標(biāo)中找到對花瓣a*值和b*值影響最顯著的因子。在5%的顯著水平下，淘汰不顯著自變量，選出偏回歸系數(shù)達到顯著或極顯著水平的因子，進入花色的回歸方程。由表3 可知，在粉花花瓣a*值的逐步回歸方程中，保留了花青素和SOD酶活性2 個因子，其余全部被剔除；在b*值的逐步回歸方程中，僅保留了色相角h這1 個因子。這一結(jié)果表明，花青素對粉花西伯利亞杏花瓣的呈色具有重要作用。

表3 粉花西伯利亞杏花瓣各指標(biāo)與花色的逐步回歸分析Table 3 Stepwise regression analysis of each index of Prunus sibirica pink flower petals and flower color

3 討論與結(jié)論

植物花色研究對觀花樹種的評價和選育均具有重要意義，是創(chuàng)新花色的關(guān)鍵性過程[11]。植物花色的表達和評價一般采用CIELAB標(biāo)準(zhǔn)色度系統(tǒng)，它能對花色進行專業(yè)性描述及分類[23]。本研究通過對粉花西伯利亞杏開花不同時期的花瓣花色參數(shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)各時期二者花瓣的花色參數(shù)均存在顯著或極顯著差異。粉花花瓣的L*值和a*值呈顯著負相關(guān)，在長春花[8]和野牡丹[24]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，但與b*值無相關(guān)性。在標(biāo)準(zhǔn)色度系統(tǒng)中a*值代表紅度值，b*值代表黃度值，在對羊蹄甲[25]花色的研究中發(fā)現(xiàn)，宮粉紫荊花瓣的L*值與a*值呈極顯著負相關(guān)，表明其花色主要受紅度值影響，而羊蹄甲花瓣的L*值與b*值呈極顯著正相關(guān)，表明其花色主要受黃度值影響。因此，在粉花西伯利亞杏花色的研究中，花色參數(shù)a*值較b*值更具參考意義。

細胞液pH值大小與花色穩(wěn)定與否密切相關(guān)[26]，pH值越低，花色越呈現(xiàn)更穩(wěn)定的紅色，伴隨著花瓣生長，pH值會出現(xiàn)升高現(xiàn)象[27]。相關(guān)分析中表明，粉花花瓣pH 值與a*值呈顯著負相關(guān)關(guān)系，在開花過程中粉花花瓣內(nèi)pH 值逐漸增大，外觀上也表現(xiàn)為花瓣粉色逐漸變淡。在對二喬玉蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，開花過程中花瓣外表從紅紫色變?yōu)榈仙?，蕾期至盛花期細胞液pH值表現(xiàn)為持續(xù)增長，但各時期差異均不顯著[28]。本研究中粉花西伯利亞杏各時期pH值差值較小，而花色同樣發(fā)生了變化，表明pH值的微小變化也會影響粉花西伯利亞杏花瓣呈色。

存在于植物細胞中的色素是影響花色的主要因素，色素種類、含量及組成比例均會影響花瓣顏色[7]。本研究通過相關(guān)分析和逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)與花瓣紅度a*值相關(guān)的關(guān)鍵色素為花青素，推測其是影響粉花西伯利亞杏花瓣顏色的主要因素，花青素也是影響紫花含笑[11]、麗格海棠[30]等植物花瓣呈色的色素。值得注意的是，在花后11 d 粉花花瓣內(nèi)花青素達到峰值，此時紅度a*值卻未達到最大值，在關(guān)于深色花的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)使花色變深的原因不僅是單方面花青素持續(xù)積累，也有顯微結(jié)構(gòu)下的色素分布[31]、花瓣結(jié)構(gòu)特點以及其他色素的共同作用等多方面因素[32]。相關(guān)分析中，粉花花瓣的類黃酮含量和類胡蘿卜素含量與紅度a*值呈極顯著正相關(guān)，二者含量的變化，一定程度上對花瓣呈色起輔助作用。大量葉綠素積累會使花瓣呈綠色[7-8]，本研究中雖在粉花花瓣中檢測出葉綠素，但對比其他3類色素含量較低，且相關(guān)分析中與紅度a*值無相關(guān)性。在花后15 d和19 d對比白花西伯利亞杏含量也無顯著差異，推測葉綠素對粉花西伯利亞杏花瓣呈色的影響較小。

可溶性糖作為能源物質(zhì)維系著植物的正常生長發(fā)育，可與花青素以糖苷鍵結(jié)合形成花色苷[24]，花色苷的含量會影響花瓣呈色，尤其是粉紅、紅色、紫色、紅紫色等深色花[33]。本研究中粉花花瓣內(nèi)的可溶性糖與花青素含量變化趨勢一致，且均在花后11 d 達到最大值，二者同步積累并合成[34]。可溶性糖作為合成花色苷的原料，其含量間接對花瓣呈色產(chǎn)生影響。前人研究發(fā)現(xiàn)花色苷的生成隨著蛋白質(zhì)增加而減弱[35]。本研究中，粉花花瓣內(nèi)可溶性蛋白含量與花青素含量呈極顯著負相關(guān)，在紅花玉蘭[36]花色形成的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律。脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)及保護酶、清除活性氧等功能[37]，可為花色苷合成提供穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境[38]，間接影響花色的變化。

SOD酶、POD酶和CAT酶同為花瓣內(nèi)清除自由基的保護酶[29]。本研究中，CAT酶活性隨著粉花的開花進程持續(xù)上升，且與花青素含量具有極顯著負相關(guān)關(guān)系，表明其活性會通過參與花瓣內(nèi)一系列生理代謝過程，直接或間接地影響花色苷的降解速度，從而影響粉花西伯利亞杏花瓣呈色[24-25]。SOD 酶活性和POD 酶活性與花青素含量無相關(guān)性，表明其活性變化對粉花西伯利亞杏花瓣呈色的影響較小。

綜上所述，粉花西伯利亞杏與白花西伯利亞杏所處環(huán)境相似，排除立地條件對花色的影響，二者花色差異是花瓣色素含量、細胞液pH、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及保護酶活性共同作用、相互影響的結(jié)果。其中，花青素作為影響粉花西伯利亞杏花瓣呈色的主要因子，其含量變化會直接影響粉花花瓣不同時期的顏色呈現(xiàn)。該研究探討了粉花西伯利亞杏花瓣顏色形成的因素和機制，可為西伯利亞杏花色調(diào)控及花色變異的品種培育創(chuàng)新提供理論參考。