白 玉，張素紅，張會(huì)麗

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南新鄭 451100）

貝母為多年生草本植物，其鱗莖供藥用，能止咳化痰、清熱散結(jié)。貝母藥材作為常見(jiàn)的中藥，其有效成分復(fù)雜，研究其藥理活性，可在臨床實(shí)踐中發(fā)揮顯著的作用。中藥貝母的有效化學(xué)成分中，已分離檢驗(yàn)出的生物堿化合物多達(dá)100余個(gè)，主要包括異甾體生物堿與膽甾衍生物。異甾體生物堿分為西藜蘆堿類和介藜蘆堿類；膽甾衍生物分為白藜蘆堿類和茄次堿類。除此之外，川貝母中還含有皂苷、萜類、甾體、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、烯烴類化合物、醇類化合物、呋喃類化合物、酮類化合物、烷烴類化合物和無(wú)機(jī)元素等多種成分。川貝母不僅具有良好的止咳化痰功效，而且能養(yǎng)肺陰、宣肺、潤(rùn)肺而清肺熱，是一味治療久咳痰喘的良藥，因此，在許多治療急性氣管炎、支氣管炎、肺結(jié)核等病癥的中藥方劑或中成藥制劑中都有川貝，如蛇膽川貝露、川貝枇杷露等，以增強(qiáng)治療疾病的效果[1]?；谏飰A及其藥物活性的研究中，對(duì)其抗腫瘤藥理活性進(jìn)行研究，能夠?yàn)樨惸傅呐R床藥用價(jià)值提供參考。

1 材料和方法

1.1 一般材料

擇取A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460非小細(xì)胞肺癌（肺癌的常見(jiàn)臨床分期，包括鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌，相比其癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚）細(xì)胞株資料進(jìn)行研究，通過(guò) UHPLC-QTOF-MS/MS 結(jié)合細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)觀察貝母提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，從而明確貝母對(duì)不同種類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的抗腫瘤作用。

取手術(shù)切除獲得的23例非小細(xì)胞肺癌組織，1 h內(nèi)移植于NOD/SCID 小鼠或BALB/c 裸鼠皮下，觀察移植瘤成瘤情況，測(cè)量移植瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線圖，計(jì)算成瘤率、成瘤潛伏時(shí)間和成瘤時(shí)間，分析并比較移植成瘤組和未成瘤組所對(duì)應(yīng)患者的相關(guān)臨床病理指標(biāo)，并取移植成瘤組和所對(duì)應(yīng)患者的組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.2 方法

將中藥川貝母的果肉和果皮分開(kāi)，通過(guò)比較不同提取溶劑、不同提取體積、不同提取方法制成待測(cè)樣品，確定待測(cè)樣品的最終制備條件。建立中藥貝母待測(cè)樣品的方法學(xué)，通過(guò)UHPLC-Q-TOF-MS 鑒定待測(cè)樣品的主要成分，并測(cè)定小鼠試樣血清中多種生物堿的濃度，計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)，觀察貝母提取物對(duì)A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460 的遷移及侵襲力是否有抑制作用。

（1）將貝母粉碎，過(guò)80～120 目篩，加入原料量5～10 倍的50%～95%乙醇溶液，40～50 ℃浸漬提取3～5 次，合并提取液，真空濃縮至原體積的3%～10%，室溫放置24 h，沉淀除糖，過(guò)濾，母液真空濃縮至干，加原料藥量0.4～0.6倍的水溶解，所得溶液通過(guò)預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂吸附，流速0.8～1.2 mL/min，吸附完畢，先用水洗脫，洗脫液棄去，再用乙醇溶液洗脫，流速3.0～10.0 mL/min，至流出液無(wú)生物堿反應(yīng)，減壓濃縮，干燥，得貝母總生物堿。

（2）貝母提取物對(duì)不同種類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的藥理活性的研究：培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460，以不同濃度的貝母提取物為實(shí)驗(yàn)組，以等量的0.9%NaCl作為對(duì)照組，采用UHPLC-QTOF-MS/MS 結(jié)合細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)觀察貝母提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并以流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行觀察。

UVB 距小鼠30 cm 處照射。供試藥物貝母生物堿提取物陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)耙明（cyclopamine），儀器UV 放射裝置（Daavlin Co.，Bryan，OH），試驗(yàn)方法用B 波段UV 照射小鼠240 mJ/cm2一周三次，直至有明顯可見(jiàn)的皮膚腫瘤出現(xiàn)，停止照射。口服給藥20周，記錄每周的腫瘤情況。然后取小鼠背部皮膚，以從組織學(xué)上研究腫瘤情況。于4℃將組織浸于0.2%戊二醛/2%甲醛-1*PBS 20 min，然后用1*PBS 洗兩次。將組織在37℃置于含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的95%鐵緩沖液中，放置24 h，以患基底細(xì)胞癌（BCC）表示部位的面積作為觀察指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 本次配藥方案

本次實(shí)驗(yàn)的配藥方案見(jiàn)表1。

表1 本次實(shí)驗(yàn)配藥方案

2.2 不同濃度的貝母醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率

A549和NCI-H157的侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，16HBE及NCI-H460次之，而貝母藥材中的生物堿類化學(xué)成分的抗腫瘤藥理活性突出，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度的貝母醇提取物對(duì)6種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率（%）

3 討論

貝母的藥理作用廣泛，在已證實(shí)的藥物活性研究中，具有顯著的抗炎作用。貝母含有多種生物堿活性成分。既往研究的相關(guān)結(jié)果證實(shí)，貝母具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛、抗氧化、藥理活性涉及抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、平喘、抗血栓、膽堿酯酶抑制、抗病毒等作用[2]。

從表2 的結(jié)果中，表明了在同一種腫瘤的抗腫瘤研究中，基于中藥貝母化學(xué)成分和藥理作用的開(kāi)發(fā)，在臨床應(yīng)用實(shí)踐中具有突出的生物活性[3]。川貝母通過(guò)JAK-STAT 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路及鞘脂信號(hào)通路等多條通路，作用于EGFR、EGF、CDC42、RHOA、KRAS、CDK1、PLK1、CDK2、CCNB1靶點(diǎn)發(fā)揮治療NSCLC 的作用。川貝母通過(guò)多種化學(xué)成分、靶點(diǎn)和通路的協(xié)同作用，發(fā)揮治療哮喘和NSCLC 的作用。采用細(xì)胞代謝組學(xué)手段，分析了貝母非小細(xì)胞肺癌A549增殖的作用機(jī)制，找出了貝母主要成分中影響較大的代謝通路等生物過(guò)程[4]。伊犁貝母中含有豐富的化學(xué)成分，生物堿類成分為其主要活性成分。體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果提示了伊犁貝母具有開(kāi)發(fā)抗腫瘤新藥的潛力，并在目標(biāo)細(xì)胞株，尤其是腫瘤細(xì)胞株的抗腫瘤機(jī)制上，以不同的體外抑制活性實(shí)驗(yàn)，在不同化合物中的IC50值（衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力）抑制作用不同。抑制活性研究表明，對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制效應(yīng)突出，IC50值最高為16.9 μm。應(yīng)用于甾體生物堿總含量的測(cè)定方法主要有分光光度法-酸性染料比色法、酶聯(lián)免疫吸附法、滴定法等；包括HPLC-UV，HPLC-ELSD，HPLC-MS 和HPLC-CAD 等，為研究其藥物活性提供了依據(jù)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究表明，單次灌胃給藥，確定小鼠的最小致死量為2 g/kg；具有一定舒張作用的受試物分別為：FPSA11、FPSA07、FPSA03、FPSA02、FPSA06、提取物Ⅰ、提取物Ⅱ；在初篩基礎(chǔ)上進(jìn)行了平喘功效的研究，受試物的拮抗作用從強(qiáng)到弱依次為：FPSA02 ＞氨茶堿、提取物Ⅰ、提取物Ⅱ＞FPSA07＞FPSA03、硝苯地平；伊貝母提取物0.5 g/kg 能夠在延長(zhǎng)咳嗽潛伏期、減少咳嗽次數(shù)、促進(jìn)酚紅分泌方面組間比較具有顯著性差異。貝母生物堿可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞核受體活性、激活轉(zhuǎn)錄因子活性、調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、調(diào)節(jié)乙酰膽堿受體活性和類固醇激素受體活性等發(fā)揮作用；KEGG通路分析顯示，平貝母生物堿可能通過(guò)TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等發(fā)揮作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示，平貝母生物堿與抗炎蛋白具有較低的結(jié)合能。貝母總生物堿、總核苷抑制P-gp 的外排活性，呈現(xiàn)濃度依賴性；浙貝母總生物堿、總核苷低劑量組Calcein 熒光比率為（134.96±11.91）%、（126.89±10.42）%， 顯著高于空白組（100.00±11.49）%（P＜0.05）。浙貝母總生物堿、總核苷高劑量組Calcein 熒光比率為（209.72±9.44）%、（162.42±7.83）%，顯著高于空白組（100.00±11.49）%。浙貝母總多糖低、高劑量組與空白組無(wú)顯著差異。

從藥物活性化作用來(lái)講，貝母具有多種藥理活性，其提取物及活性成分具有止咳，化痰，平喘，解痙，鎮(zhèn)靜，弛豫回腸，抗腫瘤，擴(kuò)瞳，興奮子宮，正性肌力，降血壓，抗凝，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的突出功效。貝母屬植物中含有許多類化學(xué)物質(zhì)，如生物堿類、皂苷類等，通常認(rèn)為貝母生物堿是其主要有效成分，為評(píng)價(jià)貝母質(zhì)量，常通過(guò)貝母生物堿的含量高低作為活性強(qiáng)弱的關(guān)鍵性標(biāo)識(shí)。貝母生物堿提取物在制備治療基底細(xì)胞癌及其他腫瘤藥物中的應(yīng)用，其作為中藥材的機(jī)理主要是通過(guò)區(qū)分出腫瘤細(xì)胞，并使其死亡，從而達(dá)到治療效果。同時(shí)能保留正常的組織細(xì)胞（包括正常表皮基層和毛囊的未被區(qū)分的其他細(xì)胞）。由于貝母生物堿提取物引起腫瘤細(xì)胞死亡的原因是通過(guò)非基因毒性機(jī)制，因此不同于放射治療和化學(xué)療法那樣，它們是通過(guò)破壞DNA 來(lái)發(fā)揮作用，對(duì)正常細(xì)胞也帶來(lái)了殺傷。依據(jù)該機(jī)理，貝母生物堿提取物特別適用于癌癥治療，能治療基底細(xì)胞癌以及其他如髓質(zhì)母細(xì)胞瘤、橫紋肌瘤、纖維肉瘤、消化道腫瘤和小細(xì)胞肺癌等通過(guò)hedgehog/圓滑信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)繁殖細(xì)胞和防止細(xì)胞凋亡的腫瘤。總之，結(jié)合表2和相關(guān)學(xué)者的資料，證實(shí)了貝母藥理活性作用效果突出，不同濃度的提取物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和藥理作用分析等表明了該藥物在臨床抗腫瘤研發(fā)領(lǐng)域的突出優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)束語(yǔ)

貝母提取物的藥理活性與藥物提取濃度呈正相關(guān)，生物堿類化學(xué)成分提取率越高，藥物活性成分越強(qiáng)。臨床通過(guò)采用技術(shù)手段對(duì)其生物堿化學(xué)成分進(jìn)行定量和定性分析，并在實(shí)際的藥理活性研究領(lǐng)域中被證實(shí)為具有推廣應(yīng)用價(jià)值的藥材。