楊學(xué)鈺,郭文帆,鄭雪君,盧吉高,楊勇,李會東

(河北省張家口市第二醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)科,河北 張家口 075000)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種復(fù)雜的關(guān)節(jié)疾病,由多種危險因素。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎在老年人中非常普遍［1-3］。治療方法包括鍛煉、體重管理、自我效能訓(xùn)練和疼痛應(yīng)對技巧,以及藥物治療。骨關(guān)節(jié)炎的分子基礎(chǔ)已被普遍接受,但確切的發(fā)病機制尚不清楚［4］。缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是對缺氧應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子,是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物,參與機體的多種生理過程,例如代謝、增殖、凋亡和血管生成,并且在炎癥相關(guān)疾病相關(guān)［5-7］,但在膝骨關(guān)節(jié)炎中的研究較少。炎性小體是多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體,在感知外界病原體或損傷后傳遞信號給免疫系統(tǒng),啟動炎癥。目前已發(fā)現(xiàn)的炎癥小體有多種,凋亡相關(guān)微粒蛋白ASC是重要的成員,調(diào)節(jié)Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡,誘導(dǎo)細(xì)胞在炎性和應(yīng)激的條件下死亡［8-9］,但是HIF-1是否可以調(diào)節(jié)ASC的表達(dá)尚不清晰。因此本研究將建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型,探究HIF-1對炎性小體ASC的調(diào)控作用,并分析其在炎性小體磷酸化修飾中的作用,為臨床研究骨性關(guān)節(jié)炎提供分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1SPF級SD大鼠 8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重180～220 g,購于斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號(SCXK 2019-0010)飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃,濕度55%,自由飲食、飲水。

1.1.2藥品與試劑 蘇木素,伊紅購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;引物由上海生工合成;HIF-1α-agomir及NC-agomir購于上海吉瑪基因公司;Rat IL-6 ELISA Kit(RAB0311),Rat TNF-α ELISA Kit(RAB0479)購于美國sigma公司,Rat IL-1β(H002)Elisa kit檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;Anti-Wnt3a抗體(ab219412,稀釋比1∶1 000),Anti-beta Catenin抗體(ab32572,稀釋比為1∶5 000),Anti-GAPDH抗體(ab82451:5000)及Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(ab6721稀釋比為1∶5 000)購于abcam公司。

1.1.3主要儀器 超低溫臺式離心機(Biofuge Primo R),美國Thermo Scientific;脫色轉(zhuǎn)移搖床,海門市其林貝爾有限公司;組織切片機(RM2335),德國徠卡公司;恒溫烤片機,廣西億創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司;光學(xué)顯微鏡(Eclipse Ts2),日本尼康公司;全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Sky High),美國Thermo Fisher公司;Western電泳儀,美國Bio-Rad。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立 將40只SPF級SD大鼠隨機分為對照組(n=10)、模型組(n=10)、陽性對照(negative control,NC)組(n=10)和si-HIF-1α組(n=10)。模型組、NC組與si-HIF-1α組建立大鼠膝關(guān)節(jié)炎模型,NC組和si-HIF-1α組分別尾靜脈注射5 nmol NC質(zhì)粒和si-HIF-1α質(zhì)粒,對照組和模型組給與等量生理鹽水。具體方法為:隨機抽取10只大鼠為空白對照組,其余大鼠采用0.5 mL胰島素針在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次注射1 g/L碘乙酸鈉構(gòu)建膝關(guān)節(jié)炎大鼠模型的造模,每只大鼠注射0.1 mL/只。正常對照組注射等量的生理鹽水,其他操作一致。造模后NC組給予5 nmol NC agomir,si-HIF-1α組給與5nmol si-HIF-1α尾靜脈注射,1周后進(jìn)行各組檢測。

1.2.2大鼠關(guān)節(jié)取材、HE染色及病理評分標(biāo)準(zhǔn) 分離大鼠后肢膝關(guān)節(jié),去除皮毛及肌腱組織,10%的多聚甲醛中浸泡固定48 h,10%EDTA脫鈣液中1個月,重新于10%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋、切片,用于HE染色。病理學(xué)評分,關(guān)節(jié)周圍炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)為:沒有炎癥細(xì)胞浸潤為0分;20個炎癥細(xì)胞(100×)為1分;20～50個炎癥細(xì)胞(100×)為2分;>50個炎癥細(xì)胞(100×)為3分。骨破壞評分:正常為0分;少量軟骨丟失為1分,骨破壞局限在獨立的區(qū)域;大片軟骨破壞,由血管翳導(dǎo)致的大片骨侵蝕為2分;關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完全破壞為3分;病理總評分:病理總評分=關(guān)節(jié)周圍炎癥評分+骨破壞評分。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測 外周血炎癥因子對各組大鼠進(jìn)行毛細(xì)管眼眶采血,每只大鼠1 mL,3 000 r/min 3min后,獲取上清,分別加入酶標(biāo)抗體,37 ℃,30 min,加入底物液,每孔100 μL,置37 ℃避光放置5min,加入終止液顯色,每孔加入反應(yīng)終止液50 μL終止反應(yīng),于20 min內(nèi)測定實驗結(jié)果,酶聯(lián)檢測儀測定吸光度OD值,每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.4各組大鼠mRNA表達(dá)水平的檢測 采用cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行HIF-1α的表達(dá)水平。使用PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行實時熒光定量PCR,循環(huán)40個PCR,使用GAPDH分別作為mRNA的對照,所有操作在冰上進(jìn)行并避免RNA酶污染,以2-△△Ct計算mRNA相對表達(dá)量［7］,引物順序見表1。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primers

1.2.5Western blot檢測膝關(guān)節(jié)組織Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá) 采血后切開各組大鼠膝關(guān)節(jié)并縱形分離周圍軟組織,PBS清洗2遍,液氮勻漿,勻漿后冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白,蛋白提取后進(jìn)行SDS-PAGE電泳80 V 10 min,120 V 1.5 h,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST漂洗4次每次5分鐘,按照各抗體稀釋濃度稀釋抗體后分別加入一抗重組Anti-ASC抗體(ab283684,英國abcam,1∶1 000),Anti-HIF-1 alpha antibody(ab1,英國abcam公司,5 mg/L),4 ℃孵育過夜,二抗常溫孵育2 h,TBST漂洗4次每次5分鐘,ECL顯色,發(fā)光儀曝光、拍照,蛋白相對定量采用photoshop對蛋白灰度進(jìn)行統(tǒng)計,各統(tǒng)計3次［10］。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1下調(diào)HIF-1α對大鼠膝關(guān)節(jié)的影響 對照組大鼠關(guān)節(jié)未見明顯炎細(xì)胞浸潤,未見明顯關(guān)節(jié)周圍炎癥和骨破壞。模型組和NC組大鼠組織內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤,關(guān)節(jié)面出現(xiàn)大量骨破壞,病理學(xué)評分高(P<0.01)。si-HIF-1α組可見部分炎性細(xì)胞浸潤,存在不同程度的增生,部分出現(xiàn)骨質(zhì)的破壞。病理總評分下降,但仍高于對照組(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)HE染色

表2 各組大鼠HE染色病理評分Table 2 Pathological score of rats in each group after HE staining 分)

2.2下調(diào)HIF-1α對各組大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子的影響 與對照組相比,模型組和NC組大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α分泌顯著升高(P<0.01),而si-HIF-1α組組大鼠外周血炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌相對于模型組NC組大鼠顯著降低(P<0.01),但仍顯著高于對照組和模型組(P<0.05)。見表3。

表3 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子的影響Table 3 Effect of down-regulation of HIF-1α on serum inflammatory factors in rats

表3 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子的影響Table 3 Effect of down-regulation of HIF-1α on serum inflammatory factors in rats

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組45.717±2.731106.441±13.122104.410±10.817模型組112.921±5.124*175.144±17.136*140.108±16.713*NC組104.041±6.411*177.140±12.262*139.116±15.816*si-HIF-1α組55.182±7.616*#123.168±12.342*#111.163±16.376*#F值31.22118.97922.860P值 <0.001<0.001<0.001

*P值<0.01與對照組比較 #P值<0.05與模型組比較(SNK-q檢驗)

2.3下調(diào)HIF-1α對各組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC mRNA表達(dá)的影響 與對照組相比,NC組合模型組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC mRNA表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而si-HIF-1α組大鼠大鼠骨關(guān)節(jié)組織的JUN及ASC mRNA表達(dá)水平均顯著低于模型組,同時顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子的影響Table 4 Effect of down-regulation of HIF-1α on inflammatory factors in joint tissues of rats

表4 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子的影響Table 4 Effect of down-regulation of HIF-1α on inflammatory factors in joint tissues of rats

組別JUNASC對照組1.127±0.1130.439±0.014模型組1.533±0.05*0.835±0.011*NC組1.507±0.063*#0.81±0.002*#si-HIF-1α組1.281±0.013*#△0.40±0.012*#△F值17.11113.119P值<0.001<0.001

*P值<0.01與對照組比較 #P值<0.05與模型組相比 △P值<0.01與NC組比較(SNK-q檢驗)

2.4下調(diào)HIF-1α對各組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比,NC組合模型組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC蛋白表達(dá)上調(diào),結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而si-HIF-1α組大鼠大鼠骨關(guān)節(jié)組織的JUN及ASC蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組,同時顯著低于對照組,結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,表5。

圖2 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC蛋白表達(dá)的影響

表5 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC蛋白表達(dá)的影響表5 Effects of down-regulation of HIF-1α on the expression of JUN and ASC proteins in bone and joint tissues of rats in each group

表5 下調(diào)HIF-1α對各組大鼠骨關(guān)節(jié)組織JUN及ASC蛋白表達(dá)的影響表5 Effects of down-regulation of HIF-1α on the expression of JUN and ASC proteins in bone and joint tissues of rats in each group

組別JUNASCp-ASC對照組1.523±0.0110.59±0.0141.49±0.014模型組1.736±0.001*0.75±0.021*1.65±0.011*NC組1.702±0.012*#0.71±0.014*#1.61±0.024*#Si-HIF-1α組1.387±0.012*#△0.20±0.019*#△1.20±0.019*#△F值12.81117.81211.819P值<0.001<0.001<0.001

*P值<0.01與對照組比較 #P值<0.05與模型組比較 △P值<0.01與NC組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)被認(rèn)為是一種軟骨疾病,其發(fā)展緩慢常被視為一種慢性病,病程通常超過10～15年,對日?；顒雍凸ぷ髂芰υ斐奢^大影響,嚴(yán)重者會發(fā)生關(guān)節(jié)殘疾、影響患者生活質(zhì)量［10-12］。OA的臨床表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)的紅、腫、熱、痛、功能障礙及關(guān)節(jié)畸形,病理變化最初發(fā)生于關(guān)節(jié)軟骨,以后侵犯軟骨下骨板及滑膜等關(guān)節(jié)周圍組織,以關(guān)節(jié)面及其邊緣的軟骨變性以及新骨形成為主要特征。發(fā)病機制較為復(fù)雜,一般認(rèn)為與衰老、創(chuàng)傷、炎癥、肥胖、自身免疫反應(yīng)、代謝和遺傳、退行性病變等因素有關(guān),但精確的分子機制尚不清晰［13-14］。低氧誘導(dǎo)因子HIF-1參與體內(nèi)環(huán)境氧濃度的平衡,當(dāng)暴露于厭氧或低氧環(huán)境中,機體會立即產(chǎn)生應(yīng)激或耐氧適應(yīng)。在氧濃度正常情況下,HIF-1特定位置脯氨酰殘基羥基化后會立即引起泛素化,在低氧條件下,HIF-1以細(xì)胞特異性表達(dá)方式調(diào)控數(shù)百個基因的轉(zhuǎn)錄［15］。研究表明HIF-1可以抑制劑治療肺動脈高壓,也有研究表明HIF-1參與了氧化應(yīng)激對腎損傷時的纖維化變化過程,但是HIF1在膝骨關(guān)節(jié)炎中的作用尚不清晰［16-17］。因此本研究通過建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型發(fā)現(xiàn),膝骨關(guān)節(jié)炎過程中大鼠膝關(guān)節(jié)損傷及病理評分均顯著升高,而下調(diào)HIF-1α后,骨關(guān)節(jié)損傷程度顯著降低,提示出HIF-1α可能參與到骨關(guān)節(jié)組織的病理損傷修復(fù)過程,由于膝骨關(guān)節(jié)炎是一種炎癥疾病,因此本研究通過ELISA探究了骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)部的炎癥因子表達(dá)水平,結(jié)果表明膝骨關(guān)節(jié)炎過程中,關(guān)節(jié)組織IL-1、IL-6、TNF-α顯著升高,而下調(diào)HIF-1α后,關(guān)節(jié)組織IL-1、IL-6、TNF-α顯著降低,提示出HIF-1α可以發(fā)揮一定的抑制炎癥因子釋放的作用,從而降低骨關(guān)節(jié)組織的炎性損傷。

ASC是NLRP3炎癥小體的重要組成部分,參與多種炎性疾病,在此過程中JUN/ASC 泛素化和磷酸化等修飾促進(jìn) NLRP3炎性體激活［18-19］,但是HIF-1是否可以調(diào)控ASC尚不清晰。因此本研究通過Western blot實驗探究HIF-1α是否可以通過影響炎性小體ASC結(jié)構(gòu)域及其磷酸化修飾來調(diào)控炎癥因子釋放,結(jié)果表明HIF-1α下調(diào)后,JUN表達(dá)水平下降,由于JUN是調(diào)控ASC磷酸化的重要分子,因此本研究分析了ASC的表達(dá)和磷酸化水平,結(jié)果表明ASC表達(dá)和磷酸化修飾均顯著降低。

綜上所述,本研究證實HIF-1可以通過調(diào)控炎性小體ASC發(fā)揮膝骨關(guān)節(jié)的保護作用,其機制與ASC的磷酸化修飾有關(guān)。本研究可以通過臨床樣本探究HIF-1和ASC在骨關(guān)節(jié)組織中的表達(dá),為臨床HIF-1α及炎性小體的研究提供有力數(shù)據(jù)支撐。