鄭一鳴,李倫蘭,陳和木

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthitis,KOA)是一種慢性勞損導(dǎo)致的關(guān)節(jié)退行性疾病,累及軟骨、軟骨下骨等結(jié)構(gòu)[1],超過(guò)35%的中老年人受其影響[2]。由于軟骨無(wú)神經(jīng)與血管組織,被破壞結(jié)構(gòu)和受損的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)緩慢。KOA常采用藥物和手術(shù)治療[3]。目前,非類固醇抗炎藥是治療KOA的常用藥物,但長(zhǎng)期用藥會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重副作用[4]。因此,對(duì)于病情較輕或存在手術(shù)禁忌證的患者,確定有效安全的干預(yù)措施非常重要。電針是一種基于針灸的中西醫(yī)結(jié)合治療方法,其原理是通過(guò)針灸和電的雙重刺激來(lái)達(dá)到治療疾病的目的[5]。雖然電針已被廣泛應(yīng)用于治療KOA,但作用機(jī)制尚未明確。

該實(shí)驗(yàn)研究電針?lè)▽?duì)兔KOA模型血清、關(guān)節(jié)液中炎癥因子的影響和關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)改變,觀察電針?lè)ㄖ委烱OA效果及其作用機(jī)制,評(píng)價(jià)電針?lè)ㄔ谥委烱OA過(guò)程中的應(yīng)用價(jià)值,拓展中醫(yī)在防治KOA中的積極意義,為KOA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組18只骨骼完整、6月齡成年雄性新西蘭兔(2.25～2.75 kg),由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并進(jìn)行飼養(yǎng)[許可證號(hào):SYXK(皖)2017-006]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):LLSC20221122)。經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,18只新西蘭兔運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法被分配到空白對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組(B組)和電針?lè)ńM(C組),每組各6只。

1.2 主要材料電子針灸治療儀(型號(hào):CMNS6-1型)購(gòu)自蘇州佳健器械總廠;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自無(wú)錫華衛(wèi)德朗公司;高速組織研磨儀購(gòu)自武漢賽維爾公司;生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、石蠟包埋機(jī)(冷臺(tái))購(gòu)自湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司;顯微鏡購(gòu)自日本NIKON公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司;兔白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β,IL-6,ELISA試劑盒購(gòu)自武漢科鹿生物公司,批號(hào):ELK1228、ELK2419;NO試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司;一抗:p-P38購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,貨號(hào)4511T;二抗:超敏兔鼠通用二抗購(gòu)自北京ZSGB-BIO公司,貨號(hào):PV-9000。

1.3 方法

1.3.1造模及干預(yù)措施 A組未經(jīng)處理,正常飼養(yǎng);B組和C組采用改良韋德曼左后肢伸直位固定制動(dòng)法[6]制備模型。助手控制兔使其呈仰臥位,操作者把兔左后肢拉至充分伸展(膝關(guān)節(jié)伸展180°,踝關(guān)節(jié)60°背屈)。從腹股溝到跖趾關(guān)節(jié)內(nèi)層纏繞綿紙,外層用樹(shù)脂繃帶包裹1周以鞏固固定,待樹(shù)脂繃帶變硬后,最外層以膠帶包裹防止兔啃咬。每天早晚巡視,若兔出現(xiàn)足趾充血、腫脹,應(yīng)立即去除繃帶,待腫脹消退后重新造模。若出現(xiàn)樹(shù)脂繃帶滑脫,應(yīng)立即修復(fù)。6周后拆除外部石膏固定裝置,驅(qū)使兔行走奔跑,B、C組兔膝關(guān)節(jié)紅腫,步態(tài)呈跛行、拖行狀,膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍受限,表明造模成功。所有兔正常飼養(yǎng)1周后繼續(xù)實(shí)驗(yàn),A、B組自由活動(dòng)、常規(guī)飼養(yǎng),每周與C組同一時(shí)間抓取5次,不做干預(yù),連續(xù)4周;C組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]敘述,選擇內(nèi)外膝眼、梁丘穴、血海穴,以0.3 mm×25.0 mm毫針進(jìn)行針刺,直刺或斜刺均可。刺入深度約5 mm,將針與電針治療儀進(jìn)行連接,強(qiáng)度以局部皮膚肌肉的輕微震顫為度,頻率為2、100 Hz疏密交替,電流強(qiáng)度 1～2 mA,治療每次20 min,每周治療5 d,休息2 d,連續(xù)4周。

1.3.2行為學(xué)觀察 干預(yù)完成后,采用改良Lequesne MG膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)估量表作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),觀察各組兔的疼痛、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動(dòng)和腫脹程度。選取2位對(duì)該實(shí)驗(yàn)分組不知情的實(shí)驗(yàn)助理?yè)?dān)任評(píng)分員,在同一時(shí)間對(duì)同一只兔進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果取均值。

1.3.3標(biāo)本采集 取材方法如下:耳緣靜脈取血3～5 ml,靜置2 h后取上清液,以3 000 r/min快速離心10 min,-80 ℃貯存待測(cè)血清中炎癥因子表達(dá)水平?？諝馑ㄈㄌ幩劳?暴露左膝淺層滑囊,在髕上囊開(kāi)口,注射器抽取1 ml無(wú)菌鹽水灌注于髕上囊中,操作人員充分活動(dòng)其膝關(guān)節(jié),重復(fù)回抽直到收集3 ml關(guān)節(jié)液,快速離心取上清液,置于-80 ℃液氮中。切開(kāi)關(guān)節(jié)囊,使膝關(guān)節(jié)腔充分暴露,切開(kāi)十字韌帶,清除半月板,分離關(guān)節(jié)。使用咬骨鉗取左側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁,沖洗后固定于4%多聚甲醛中48 h,經(jīng)修剪、乙醇梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色,鏡下觀察拍照記錄。根據(jù)Mankin分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)軟骨退化程度進(jìn)行分級(jí)。

1.3.4ELISA法檢測(cè)血清、關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β含量 按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,將試樣置于酶標(biāo)板孔的底端,輕輕搖晃攪拌均勻,將蓋板或薄膜覆于酶標(biāo)板上方,37 ℃下孵育80 min后清洗。添加 TMB顯色劑溶液,37 ℃下避光培養(yǎng)20 min。最后加入終止液進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5Griess法檢測(cè)血清及關(guān)節(jié)液NO水平 按照試劑說(shuō)明書(shū)操作,取出Griess reagentⅠ和Ⅱ,靜置恢復(fù)室溫。用待測(cè)樣品所用溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,按50 μl/孔,96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。按50 μl/孔,各孔中加入室溫Griess reagent Ⅰ,按50 μl/孔,在各孔中加入室溫Griess reagent Ⅱ,540 nm測(cè)定吸光度值。

1.3.6HE染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài) 切片后行HE染色,將染色后切片放置于鏡下放大100倍觀察。使用Mankin評(píng)分法對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨退化程度進(jìn)行評(píng)分,得分越高,說(shuō)明軟骨退化程度越明顯。

1.3.7免疫熒光染色法觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織p-P38 MAPK表達(dá) 取制備的石蠟切片經(jīng)脫蠟、孵育、水洗、浸泡,抗原修復(fù)后孵p-P38一抗過(guò)夜,孵二抗50 min,復(fù)染細(xì)胞核后甘油明膠封片,顯微鏡鏡檢。每組切片隨機(jī)選取3個(gè)100倍視野拍照,使用Image J軟件進(jìn)行圖像采集分析。藍(lán)色熒光為DAPI表達(dá),紅色熒光為p-P38陽(yáng)性表達(dá),Merge為雙重?zé)晒馊旧?/p>

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組兔Lequesne評(píng)分升高 (P<0.05);與模型對(duì)照組比較,電針?lè)ńM兔Lequesne評(píng)分降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 兔KOA模型行為學(xué)觀察

2.2 各組兔血清、膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組兔血清、膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO水平升高 (P<0.05);與模型對(duì)照組比較,電針?lè)ńM兔血清、膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO水平降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 各組兔血清中IL-1β、IL-6、NO表達(dá)水平

圖3 各組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO表達(dá)水平

2.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織鏡下病理形態(tài)觀察HE染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組軟骨細(xì)胞核完好,呈梭狀有序排列,可見(jiàn)清晰潮線;模型對(duì)照組切面損傷較大,細(xì)胞簇狀無(wú)序排列,潮線不清;電針?lè)ńM軟骨細(xì)胞外形基本正常,胞核和胞膜完好,可辨潮線。見(jiàn)圖4。

圖4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織鏡下病理形態(tài) HE×100

2.4 軟骨組織Mankin評(píng)分與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組Mankin評(píng)分升高(P<0.05);與模型對(duì)照組相比,電針?lè)ńMMankin評(píng)分降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評(píng)分比較

2.5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織免疫熒光p-P38表達(dá)與空白對(duì)照組比較,模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織p-P38免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05);與模型對(duì)照組相比,電針?lè)ńM膝關(guān)節(jié)軟骨組織p-P38免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。見(jiàn)圖6、7。

圖6 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織免疫熒光染色 ×100

圖7 各組免疫熒光染色p-P38陽(yáng)性細(xì)胞比例比較

3 討論

KOA是影響人類健康的常見(jiàn)關(guān)節(jié)疾病之一,通常認(rèn)為是生物學(xué)和機(jī)械損傷共同作用下,軟骨細(xì)胞、軟骨外基質(zhì)等合成降解失衡產(chǎn)生的結(jié)果。研究[8]表明,炎性因子及軟骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子是導(dǎo)致KOA發(fā)病的重要因素。

針灸療法,包括手針、電針等,被認(rèn)為是預(yù)防和延緩KOA進(jìn)展的有效干預(yù)措施。研究[9]表明,手針對(duì)于KOA患者具有一定治療效果。電針在手針的基礎(chǔ)上,將針灸與電脈沖相結(jié)合,其機(jī)制可能是內(nèi)分泌系統(tǒng)釋放激素,自主神經(jīng)系統(tǒng)釋放神經(jīng)遞質(zhì),調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌和機(jī)體免疫反應(yīng),緩解患者的臨床癥狀。研究[10]表明,電針?lè)▽?duì)KOA有良性作用,但具體機(jī)制尚不明確。

該研究采用Lequesne評(píng)分評(píng)價(jià)電針?lè)ǜ深A(yù)治療后的各組兔膝關(guān)節(jié)功能。評(píng)分結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組相比,電針?lè)ńM兔Lequesne評(píng)分顯著降低(P<0.05),表明電針?lè)芨纳芀OA膝關(guān)節(jié)功能,對(duì)KOA有一定治療作用。

細(xì)胞因子由多種細(xì)胞分泌、調(diào)控、介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)。研究[11]表明,IL-1β、IL-6、NO在KOA患者滑液中表達(dá)增加。IL-1β可促進(jìn)金屬蛋白酶MMP家族和Ⅱ類膠原蛋白合成,誘導(dǎo)性NO合成酶激活,產(chǎn)生大量下游產(chǎn)物[12],強(qiáng)烈刺激iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄,合成大量NO[13]。高濃度NO一方面抑制軟骨細(xì)胞,降低其再生能力;另一方面增強(qiáng)血管通透性,導(dǎo)致關(guān)節(jié)液滲出。IL-6只在KOA患者滑膜中可被檢出,加劇關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[14],調(diào)節(jié)MMPs,促進(jìn)破骨細(xì)胞激活,加速基質(zhì)和成纖維細(xì)胞的降解,進(jìn)一步損害膝關(guān)節(jié)軟骨。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由多種細(xì)胞因子活化的絲氨酸-蘇氨酸激酶,受IL-1β等炎性因子刺激時(shí),MAPK通路以逐步磷酸化的方式被激活,加快誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解,誘發(fā)KOA。研究[15]表明,MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是KOA重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等多種生理過(guò)程。該研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,KOA兔經(jīng)過(guò)4周電針?lè)ㄖ委熀?血清、關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO表達(dá)水平較模型對(duì)照組降低(P<0.05),膝關(guān)節(jié)軟骨組織中p-P38表達(dá)較模型對(duì)照組下降(P<0.05)。鏡下病理形態(tài)觀察電針?lè)ńM呈大致正常狀態(tài),與Mankin評(píng)分結(jié)果一致,表明電針?lè)ㄖ委烱OA機(jī)制是一種多靶點(diǎn)、多機(jī)制的綜合調(diào)控系統(tǒng):軟骨表面損傷導(dǎo)致血管裂紋增多,同時(shí),炎癥因子刺激軟骨,引起軟骨鈣化。干擾軟骨和軟骨之間相互作用,形成KOA的“惡性循環(huán)”。電針?lè)ㄍㄟ^(guò)下調(diào)血清和關(guān)節(jié)液中炎性因子表達(dá)水平,阻遏細(xì)胞內(nèi)炎性物質(zhì)釋放,阻止了“惡性循環(huán)”的發(fā)生。