王思淇,陶偉濤,許阿磊,薛楊央,汪 會(huì)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的癌癥之一,也是導(dǎo)致女性死亡的主要原因[1]。放療主要依靠高能電離輻射和活性氧的作用,來(lái)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)DNA鏈的損傷,進(jìn)而滅殺腫瘤細(xì)胞。然而,乳腺癌的放療低敏感性仍然是治療效果不佳的重要原因之一[2-3]。隨著人類(lèi)對(duì)乳腺癌認(rèn)識(shí)的不斷加深,出現(xiàn)了許多分子水平的靶向治療手段,為乳腺癌的治療提供了新方法。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制劑(PARP inhibitor, PARPi)可以阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)通路并有放療增敏作用[4]。奧拉帕尼(Olaparib)是市場(chǎng)上第一個(gè)PARP抑制劑,它可以抑制PARP的活性。PARP是修復(fù)單鏈DNA斷裂的一個(gè)主要因素。抑制PARP可以導(dǎo)致更多有害的雙鏈DNA斷裂,并增加基因組的不穩(wěn)定性,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-6]。正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography,PET/CT)是臨床常用的診斷方法,對(duì)腫瘤的臨床診斷和療效評(píng)價(jià)具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立MCF-7乳腺癌裸鼠模型,探討18F-FLT Micro PET/CT顯像在評(píng)價(jià)Olaparib的放射增敏作用中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清和0.25%胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)和磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;Olaparib購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Ki-67及PCNA免疫組化試劑均購(gòu)自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只雌性BALB/C裸鼠,SPF級(jí),4～5周齡,體質(zhì)量20～25 g,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0001]。該研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):LLSC20190249)。

1.3 主要儀器Inveon Micro PET/CT購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子公司;放療采用VARIAN 23 EX 醫(yī)用直線加速器購(gòu)自美國(guó)VARIAN公司;FLT前體購(gòu)自北京派特生物技術(shù)有限公司;18F-FLT由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科生產(chǎn),放化純度>95% 。

1.4 腫瘤模型的建立和分組24只BALB/C裸鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、單純放療組、Olaparib組和Olaparib+放療組,每組 6 只。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞,細(xì)胞密度均調(diào)整至 5×106個(gè)/ml,根據(jù)分組然后分別于裸鼠右上肢腋下注射 0.2 ml細(xì)胞,待腫瘤最大直徑≥0.8 cm 時(shí)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。單純放療組:使用6 Mev電子線進(jìn)行局部照射,照射野10 cm×10 cm;單次照射劑量4 Gy,隔日照射1次,共4次,7 d完成,累計(jì)照射劑量16 Gy;Olaparib組:按照每只每天50 mg/kg的劑量行Olaparib生理鹽水懸濁液灌胃處理,共 7 d。Olaparib+放療組:灌胃方法及劑量同Olaparib組,放療方法及劑量同單純放療組。對(duì)照組:給予每天生理鹽水灌胃,未經(jīng)照射。各組裸鼠治療前一天和治療結(jié)束后48 h,分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只裸鼠腫瘤長(zhǎng)短徑,根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積:體積=長(zhǎng)徑×短徑2×0.5。

1.518F-FLT Micro PET/CT顯像與圖像分析4組乳腺癌裸鼠模型均于放療前及第4次放療結(jié)束后48 h,行 Micro PET/CT顯像。裸鼠于顯像前夜禁食,可自由飲水。在掃描開(kāi)始前 60 min,將裸鼠固定,每只裸鼠通過(guò)尾靜脈注射18F-FLT約 5.55 MBq(150 μCi),掃描前給予1%異氟烷麻醉并俯臥位固定于掃描床上進(jìn)行顯像。顯像完成后,由2位高年資的核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師對(duì)PET /CT 圖像進(jìn)行分析,選擇病灶18F-FLT放射性濃聚最高的層面測(cè)量SUVmax和平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmean)作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。通過(guò)公式計(jì)算各腫瘤組織TPV:TPV=SUVmean×腫瘤體積。各組裸鼠顯像全部完成后,采取頸椎脫臼法處死裸鼠。

1.6 免疫組化分析取出腫瘤組織,將各組裸鼠移植瘤稱(chēng)重,然后計(jì)算抑瘤率,其公式為:抑瘤率(%)=(對(duì)照組腫瘤平均質(zhì)量-治療組腫瘤平均質(zhì)量)/對(duì)照組腫瘤平均質(zhì)量×100%。稱(chēng)量完畢后立即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,4 μm切片行Ki-67及PCNA免疫組化檢測(cè)。在高倍視野下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照分析,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.118F-FLT Micro PET/CT顯像結(jié)果24只裸鼠 Micro PET/CT 顯像右上肢腋下均可見(jiàn)結(jié)節(jié)狀放射性攝取不同程度增高灶,腫瘤與周?chē)M織分界清晰,部分腫瘤內(nèi)見(jiàn)片狀放射性攝取缺損區(qū)。見(jiàn)圖1。治療前,4 組腫瘤SUVmax、TPV及腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.041、0.061、0.045,P>0.05),治療結(jié)束后48 h,4 組腫瘤SUVmax、TPV及腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.119、13.861、44.313,P<0.001);對(duì)照組和Olaparib組腫瘤SUVmax較治療前升高;單純放療組和Olaparib+放療組腫瘤SUVmax較治療前減低,Olaparib+放療組腫瘤的SUVmax、TPV和腫瘤體積均低于單純放療組。見(jiàn)表1。經(jīng)稱(chēng)量4組瘤體體質(zhì)量分別為(1.448±0.115)、(1.103±0.127)、(1.393±0.140)和(0.653±0.150),Olaparib+放療組瘤體體質(zhì)量明顯低于其他3組(F=44.405,P<0.001),Olaparib+放療組較單純放療組相比瘤體體質(zhì)量更小(t=5.598,P<0.05)。通過(guò)計(jì)算單純放療組、Olaparib組和Olaparib+放療組抑瘤率分別為23.82%、3.80%和54.89%。

圖1 各組乳腺癌裸鼠治療前后18F-FLT Micro PET/CT 顯像圖

表1 各組乳腺癌裸鼠治療前后腫瘤SUVmax變化

2.2 免疫組化結(jié)果Ki-67和PCNA均在腫瘤組織中高表達(dá)。4組腫瘤組織中Ki-67表達(dá)的平均吸光度值分別為(64.932±7.288)、(49.382±9.482)、(63.748±6.920)、(35.060±7.183),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=16.289,P<0.001),其中Olaparib+放療組平均吸光度值明顯低于單純放療組(t=2.692,P<0.05)。4組腫瘤組織中PCNA表達(dá)的平均吸光度值分別為(80.460±6.702)、(63.280±6.800)、(79.826±3.700)、(48.102±3.885),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.645,P<0.001),Olaparib+放療組平均吸光度值明顯低于單純放療組(t=4.333,P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組荷乳腺癌裸鼠腫瘤組織Ki-67及PCNA免疫組織化結(jié)果 ×400

2.3 SUVmax與 Ki-67及PCNA表達(dá)的相關(guān)性分析腫瘤SUVmax與Ki-67 、PCNA表達(dá)均呈明顯正相關(guān)(rKi-67=0.920,P<0.01;rPCNA=0.918,P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 SUVmax與Ki-67及PCNA表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

乳腺癌是婦女癌癥死亡的第二大原因[7]。在臨床上由于乳腺癌對(duì)放療的敏感性較低,所以放療經(jīng)常與其他治療方法聯(lián)合使用[8]。PARPi是第一個(gè)臨床批準(zhǔn)的旨在利用合成致死性的藥物,在BRCA1或BRCA2中攜帶種系突變的患者中產(chǎn)生的腫瘤對(duì)PARPi敏感。然而,與其他靶向治療一樣,對(duì)PARPi的耐藥性出現(xiàn)在晚期疾病中,所以尋求組合治療方法是解決問(wèn)題的方法之一。如將化療方案與PARPi組合、PARPi與抗CTLA4和抗PD1 / PDL-1等免疫療法的組合、PARPi與癌癥特異性特征起作用的藥物有益地結(jié)合等。該文將放療與PARPi結(jié)合,通過(guò)放療來(lái)對(duì)DNA鏈造成損傷,PARPi來(lái)抑制DNA鏈的修復(fù),增加DNA修復(fù)的復(fù)雜性,從而造成更大的DNA損傷。Olaparib是PARPi的代表之一,具有抑制單鏈DNA斷裂修復(fù)的作用,以加速癌細(xì)胞的死亡。在其他研究中,奧拉帕尼還具有放射增敏的效果[9]。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建裸鼠MCF-7乳腺癌模型,并將放療與Olaparib兩種治療手段聯(lián)合,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出聯(lián)合治療比單一治療更能抑制腫瘤的生長(zhǎng),也進(jìn)一步表明了Olaparib確實(shí)具有放射增敏的效果。

PET/CT不僅可以用于乳腺癌的診斷與分析,還可以用于乳腺癌的療效判斷。近年來(lái),18F-FLT作為一種胸苷嘧啶類(lèi)似物,已被開(kāi)發(fā)為增殖追蹤劑,它可以被胸腺嘧啶脫氧核苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)磷酸化后滯留在細(xì)胞內(nèi),用PET成像和測(cè)量增殖可以為該研究提供一種無(wú)創(chuàng)的分期工具和監(jiān)測(cè)并評(píng)價(jià)放化療對(duì)腫瘤的早期療效,已被證實(shí)可用于乳腺癌[10],且腫瘤組織攝取18F-FLT的數(shù)量分別與Ki-67及PCNA有顯著相關(guān)性[11-12]。最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)是PET/CT在腫瘤診斷中常用的半定量指標(biāo),經(jīng)常被用于多種腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)價(jià)中,在該實(shí)驗(yàn)中通過(guò)監(jiān)測(cè)SUVmax的變化來(lái)反映腫瘤組織對(duì)18F-FLT的攝取程度從而表現(xiàn)出腫瘤的增殖活性;治療后48 h,單純放療組和Olaparib+放療組的腫瘤SUVmax均較放療前降低,降低了對(duì)18F-FLT的攝取,體現(xiàn)出腫瘤組織的增殖受到了抑制;通過(guò)比較顯示Olaparib+放療組的腫瘤SUVmax、TPV和腫瘤體積明顯低于單純放療組,Olaparib+放療組的瘤體體質(zhì)量明顯低于其他3組,并且抑瘤率最高。Olaparib聯(lián)合放療比單純放療可以更明顯降低腫瘤組織對(duì)18F-FLT的攝取,說(shuō)明聯(lián)合治療可以更大程度上抑制腫瘤組織的增殖能力。

不受控制的增殖是癌癥的標(biāo)志。在乳腺癌中,免疫組化評(píng)估細(xì)胞染色中Ki-67的比例已成為比較腫瘤樣品之間增殖的最廣泛使用的方法。Ki-67越來(lái)越多地在這些情況下用于臨床研究,包括作為臨床試驗(yàn)的主要療效終點(diǎn),有時(shí)用于臨床管理[13]。PCNA是DNA復(fù)制和修復(fù)的重要因素,因其在復(fù)制中的作用而被稱(chēng)為增殖的分子標(biāo)志物[14]。免疫組化結(jié)果顯示接受放療的兩組荷瘤裸鼠Ki-67及PCNA表達(dá)均低于未接受放療組,同時(shí),Olaparib+放療組相比單純放療組有著更低的Ki-67及PCNA表達(dá)。此外SUVmax與Ki-67及PCNA表達(dá)分別均呈正相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了18F-FLT Micro PET /CT 顯像能反映腫瘤細(xì)胞增殖能力。為乳腺癌的治療監(jiān)測(cè)及制定個(gè)性化治療策略作出貢獻(xiàn)。