蔣小剛　王華　周武先　由金文　張美德

摘要［目的］優(yōu)化白術(shù)葉片DNA提取方法，提取高質(zhì)量DNA，用于分子生物學(xué)研究。［方法］以白術(shù)葉片為材料，比較常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法、試劑盒法提取DNA的效果，并對(duì)改良CTAB法中的裂解溫度、裂解時(shí)間、核分離液解離次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，用瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA的濃度和純度。最后通過(guò)ISSR-PCR驗(yàn)證優(yōu)化的改良CTAB法提取DNA的效果。［結(jié)果］4種方法中，改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA效果最好。針對(duì)葉片的改良CTAB法的優(yōu)化條件為裂解溫度65 ℃、裂解時(shí)間20 min、解離次數(shù)2 次；ISSR-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，無(wú)拖尾。［結(jié)論］優(yōu)化后的改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA質(zhì)量高，可用于白術(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞白術(shù)；DNA；提取方法；改良CTAB法

中圖分類號(hào)R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）11-0128-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.032開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of DNA Extraction Method for Atractylodes macrocephala Leaves

JIANG Xiao-gang，WANG Hua，ZHOU Wu-xian et al（Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000）

Abstract［Objective］To optimize the DNA extraction method of Atractylodes macrocephala leaves and extract high-quality DNA for molecular biology research.［Method］A.macrocephala leaves were used as material，the DNA extraction effects of four methods （conventional CTAB，modified CTAB，SDS and Kit method） were compared，and the cracking temperature，cracking time and times of nuclear separation liquid extraction in the modified CTAB method were optimized，the concentration and purity of the extracted DNA were detected by agarose gel electrophoresis and spectrophotometer.Finally，the effects of DNA extracted by the modified CTAB method after optimization was verified by ISSR analysis.［Result］Among the four extraction methods，the modified CTAB method had the best extraction effects of DNA.The optimal extraction conditions of the improved CTAB method of leaves were as follows：cracking temperature was 65 ℃，cracking time was twenty minutes，dissociation times was twice.The ISSR-PCR validation results showed that the amplified bands were clear and stable，without any trailing.［Conclusion］The optimized CTAB method was effective in extracting DNA of A.macrocephala leaves.And it could be used for genetic diversity analysis of A.macrocephala.

Key wordsAtractylodes macrocephala;DNA;Extraction method;Modified CTAB method

白術(shù) （Atractylodes macrocephala Koidz.） 屬于菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，以根莖入藥，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎的功效［1］。基于分子生物學(xué)技術(shù)開展藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)工作尤為重要，而高效提取DNA是更好進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提，此外，大多數(shù)藥用植物組織中富含多糖、多酚等物質(zhì)，常規(guī)方法提取的DNA較難滿足PCR、基因克隆、測(cè)序等分子生物學(xué)需求，因此很多學(xué)者開展了藥用植物基因組DNA提取方法的優(yōu)化研究，以建立高效提取高質(zhì)量DNA的方法。

邵亞林等［2］以杏黃兜蘭葉片為材料，比較了CTAB法、改良CTAB法、高鹽低pH法和 SDS法提取DNA的效果，結(jié)果表明，改良CTAB法優(yōu)于其他方法，但提取的DNA存在一定蛋白質(zhì)污染，且未進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證。鄭斯斯等［3］以殼斗科植物葉片為材料，比較不同方法提取DNA效果并對(duì)最佳方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后的改良CTAB法提取DNA濃度和純度高，適用于PCR擴(kuò)增和酶切反應(yīng)。針對(duì)不同藥用植物或藥用植物的不同組織，需建立相適應(yīng)的DNA提取方法，而有關(guān)白術(shù)不同組織基因組DNA提取方法的研究較少，多采用CTAB法。如黃恒等［4］對(duì)改良CTAB法和SDS法提取白術(shù)葉片基因組DNA的效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA質(zhì)量高于SDS法，可作為模板用于分子標(biāo)記研究，但提取DNA用時(shí)較長(zhǎng)；王志安等［5］采用CTAB法提取白術(shù)幼嫩葉片的基因組DNA，并構(gòu)建了DNA指紋圖譜，結(jié)果表明，提取的白術(shù)基因組DNA適用于AFLP指紋圖譜分析，但存在一定量蛋白質(zhì)、多酚等物質(zhì)污染；曹亮等［6］采用改良CTAB法提取白術(shù)、蒼術(shù)的干種子DNA，并通過(guò)多重PCR技術(shù)對(duì)白術(shù)、蒼術(shù)混雜種子進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明，提取的DNA模板滿足于多重PCR反應(yīng)，但提取DNA所需時(shí)間較長(zhǎng)。也有研究采用試劑盒法提取白術(shù)DNA，如余亞?wèn)|等［7］采用試劑盒法提取白術(shù)、蒼術(shù)根莖DNA，并建立了鑒別白術(shù)、蒼術(shù)等的DNA條形碼技術(shù)，結(jié)果表明，提取的DNA模板適用于PCR擴(kuò)增及進(jìn)一步的種質(zhì)鑒定研究，但DNA提取量較低，且成本高。以上研究，以白術(shù)為研究對(duì)象，主要采用改良CTAB法提取基因組DNA，基本能滿足分子生物學(xué)的研究，但存在用時(shí)較長(zhǎng)、DNA質(zhì)量偏低的問(wèn)題，雖然試劑盒法能有效去除DNA中的多糖多酚物質(zhì)，但成本較高、提取DNA量較少，同時(shí)伴隨一定降解［3］。該研究以白術(shù)幼嫩葉片為材料，比較常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法、試劑盒法提取DNA的效果，并對(duì)改良CTAB法中的裂解溫度、裂解時(shí)間、解離次數(shù)等因素進(jìn)行優(yōu)化，然后用瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度和純度，最后通過(guò)ISSR-PCR驗(yàn)證優(yōu)化的改良CTAB法提取DNA的效果，以便用于白術(shù)遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定等研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料供試材料包括一年生白術(shù)幼嫩葉片。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）、核糖核酸A（RNaseA）、氯仿、異戊醇、異丙醇、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖，均購(gòu)自武漢中恩科技有限公司。主要儀器設(shè)備包括離心機(jī)（SIGMA 3K15）、電泳儀（DYCP-31DN）、超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo NANODROP ONE）、PCR儀（DYY-12）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1不同DNA提取方法。采用常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法和試劑盒法提取白術(shù)葉片基因組DNA。

1.2.1.1常規(guī)CTAB法。參照馬輝等［8］的方法并進(jìn)行改進(jìn)，具體步驟如下：取0.2 g白術(shù)幼嫩葉片于預(yù)冷研缽中，液氮中迅速研磨后轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入800 μL CTAB核裂解液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA，pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2％CTAB;2％PVP;2％β-巰基乙醇）和20 mg/mL蛋白酶K 5 μL，65 ℃水浴40 min（期間每隔10 min輕輕搖動(dòng)離心管一次），然后加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），混勻30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液至2 mL離心管中，然后加入等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，12 000 r/min離心15 min，棄上清。用95％乙醇清洗沉淀2次，室溫風(fēng)干，加50 μL TE緩沖液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混勻，室溫放置30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2改良CTAB法。取0.2 g白術(shù)幼嫩葉片于預(yù)冷研缽中，液氮中迅速研磨后轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入1.5 mL 4 ℃預(yù)冷的核分離液混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清收集沉淀，將上述收集沉淀按常規(guī)CTAB法提取。

1.2.1.3SDS法。參照王景雪等［9］的方法稍作改動(dòng)，具體步驟如下：①取0.2 g白術(shù)幼嫩葉片于預(yù)冷研缽中，液氮中迅速研磨后轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入800 μL溶液I （500 mmol/L NaCl;50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA;2％PVP;2％β-巰基乙醇），置于室溫?cái)?shù)分鐘至解凍；②加入280 μL 10％SDS，輕輕混勻，45～65 ℃水浴20～40 min（期間每隔10 min輕輕搖動(dòng)離心管一次）；③取出后立即置于冰上，并加入120 μL 5 mol/L 醋酸鉀于冰上反應(yīng)30 min，在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min；④取上清液，加入等體積異丙醇，輕輕混勻后，-20 ℃放置1 h，于4 ℃下離心20 min；⑤棄上清液，用500 μL TE緩沖液溶解沉淀，向其中加入2/3體積的氯仿-異戊醇（24∶1）混勻后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；⑥取上清液，向其中加入等體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaCl，于-20 ℃放置1 h，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min；⑦棄上清，用95％乙醇洗滌沉淀1次，室溫風(fēng)干；⑧加50 μL TE緩沖液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混勻，室溫放置30 min，然后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4試劑盒法。采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組提取試劑盒（DP320-02）。具體步驟如下：①取植物新鮮組織100 mg或干重組織20 mg加入液氮充分碾磨；②加入400 μL緩沖液LP1和6 μL RNaseA（10 mg/mL）旋渦振蕩1 min，室溫放置10 min；③加入130 μL緩沖液LP2，充分混勻旋渦振蕩1 min，然后12 000 r/min離心5 min，將上清移至新的離心管中；④加入1.5倍體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩混勻15 s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀；⑤將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中，然后12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑥向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），然后12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑦重復(fù)操作步驟⑥；⑧12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3室溫放置2 min徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；⑨將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50～200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.2.2改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.2.1裂解溫度優(yōu)化。采用改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA，裂解溫度設(shè)為45、55、65 ℃，其他條件不變，詳見“1.2.1.2”。

1.2.2.2裂解時(shí)間優(yōu)化。采用改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA，裂解時(shí)間設(shè)為20、30、40 min，其他條件不變，詳見“1.2.1.2”。

1.2.2.3核分離液解離次數(shù)優(yōu)化。采用改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA，解離次數(shù)設(shè)為0、1、2次，其他條件不變，詳見“1.2.1.2”。

1.2.3DNA提取濃度和純度檢測(cè)。

1.2.3.1超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)。取2 μL DNA提取液，用超微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度（ng/μL）和純度。DNA提取量（mg/g）＝DNA濃度×50×10-6/組織鮮重或干重；DNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.80時(shí)，純DNA；當(dāng)OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.80～2.00時(shí)，屬于正常范圍；當(dāng)OD₂₆₀/OD₂₈₀＞2.00時(shí)，說(shuō)明有大量RNA污染；當(dāng)OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.80時(shí)，說(shuō)明有蛋白質(zhì)、酚類等污染。

1.2.3.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，并用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照。

1.2.3.3改良CTAB法優(yōu)化后的效果驗(yàn)證。采用優(yōu)化的改良CTAB法提取白術(shù)葉片基因組DNA，并以此為模板，用中藥材條形碼引物ITS2（F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）和ISSR引物UBC845（5′-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：20 μL反應(yīng)體系中，2×Taq Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，引物2 μL，ddH2O 7 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性0.50 min，56 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.0 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1不同方法提取白術(shù)葉片DNA的效果比較用常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法和試劑盒法提取白術(shù)葉片基因組DNA，結(jié)果如表1所示。4種方法中，改良CTAB法的DNA提取量最高，為0.015 1 mg/g；試劑盒法的DNA提取量?jī)H次于改良CTAB法；SDS法提取量最低，僅為0.005 0 mg/g。除試劑盒法外的其他3種方法葉片DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在正常范圍（1.80～2.00）。綜上所述，改良CTAB法為提取白術(shù)葉片DNA的最優(yōu)方法。

2.2裂解溫度對(duì)改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA效果的影響由表2可知，裂解溫度在45～55 ℃，隨著裂解溫度升高，改良CTAB法的白術(shù)葉片DNA提取量呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。裂解溫度為65 ℃時(shí)， DNA提取量最高，達(dá)到了0.027 7 mg/g。不同裂解溫度下，白術(shù)葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.92～1.96，表明不同裂解溫度對(duì)改良CTAB法DNA提取純度無(wú)明顯影響。綜上可知，改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA的最適裂解溫度為65 ℃。

2.3裂解時(shí)間對(duì)改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA效果的影響由表3可知，裂解時(shí)間在20～40 min，隨著裂解時(shí)間增加，白術(shù)葉片DNA提取量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)，裂解時(shí)間為20 min時(shí)，葉片DNA提取量最高（0.024 0 mg/g）。裂解時(shí)間為20、30 min時(shí)，葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.95～1.97，DNA較為干凈，無(wú)明顯蛋白質(zhì)、RNA污染，而裂解時(shí)間為40 min時(shí)，葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀僅為1.63，DNA含有少量雜質(zhì)，存在一定蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)污染。綜上所述，改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA的最佳裂解時(shí)間為20 min。

2.4核分離液解離次數(shù)對(duì)改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA效果的影響由表4可知，隨著核分離液解離次數(shù)增加，葉片DNA提取量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，即葉片DNA提取量最大時(shí)的解離次數(shù)為2次。不同解離次數(shù)下，葉片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在正常范圍（1.80～2.00）。綜上所述，改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA的最佳解離次數(shù)為2次。

2.5優(yōu)化的改良CTAB法提取DNA的效果驗(yàn)證用優(yōu)化的改良CTAB法提取白術(shù)葉片基因組DNA，以此為模板，用中藥材條形碼引物ITS2和引物UBC845進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證提取DNA的效果，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定、無(wú)雜帶，優(yōu)化的改良CTAB法提取的白術(shù)葉片基因組DNA可用于后續(xù)白術(shù)遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定等研究。

3討論與結(jié)論

目前的研究多采用改良CTAB法的試劑盒法提取白術(shù)葉片、根莖、種子的基因組DNA［5-7］，且僅有黃恒等［4］以白術(shù)葉片為材料比較了改良CTAB法、SDS法提取DNA效果。該研究以白術(shù)葉片為材料，比較了常規(guī)CTAB法、改良CTAB法、SDS法、試劑盒法提取DNA效果，發(fā)現(xiàn)相比常規(guī)CTAB法、SDS法，改良CTAB法提取葉片DNA質(zhì)量較高，與黃恒等［4］研究認(rèn)為改良CTAB法提取白術(shù)葉片效果優(yōu)于SDS法的結(jié)論一致。該研究中，改良CTAB法的DNA提取量略高于試劑盒法，且試劑盒法提取DNA成本較高。綜合來(lái)看，改良CTAB法為提取白術(shù)葉片DNA的最佳方法。目前，改良CTAB法已廣泛應(yīng)用于提取油菜等作物［10-13］的基因組DNA，提取效果較好。

針對(duì)特定的分子水平的研究，往往需要提取植物特定組織的DNA，而不同組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分的差異導(dǎo)致同一方法提取不同組織DNA效果差異較大，因此需要優(yōu)化適應(yīng)于植物不同組織的DNA提取方法［14］。水浴裂解時(shí)間對(duì)于DNA提取效果非常重要，裂解時(shí)間過(guò)短，DNA不能釋放完全，導(dǎo)致提取率較低，而裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，DNA會(huì)發(fā)生降解［15］。該研究通過(guò)分析改良CTAB法中裂解時(shí)間對(duì)白術(shù)葉片DNA提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)裂解時(shí)間為20 min時(shí)，葉片DNA的提取量最高，低于以白術(shù)葉片、種子為材料的研究采用的裂解時(shí)間［5，7，9］，表明該研究對(duì)白術(shù)改良CTAB法的裂解時(shí)間的優(yōu)化效果較好。

細(xì)胞質(zhì)中多酚類等次生代謝物質(zhì)會(huì)影響DNA提取量，PVP 能有效去除DNA中的多酚物質(zhì)；β-巰基乙醇能有效防止酚氧化成醌類物質(zhì)，避免褐變，使酚易被去除；因此通過(guò)在核分離液中加入PVP和β-巰基乙醇，經(jīng)過(guò)核分離液除去多酚類物質(zhì)，可有效提高DNA的提取量［8，16-17］。該研究通過(guò)分析改良CTAB法中核分離液解離次數(shù)對(duì)白術(shù)葉片DNA提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)白術(shù)葉片解離2 次，DNA提取量最高。

優(yōu)化后的改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA效果好，可用于白術(shù)遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、分子輔助育種等。但該研究?jī)H對(duì)改良CTAB法提取白術(shù)葉片DNA的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，針對(duì)特定分子試驗(yàn)需求，還需做進(jìn)一步改進(jìn)，以更好開展后續(xù)白術(shù)分子生物學(xué)研究，為白術(shù)遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定等奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2020年版 一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：107.

［2］ 邵亞林，司俊波，?，|，等.杏黃兜蘭基因組DNA提取方法比較［J］.園藝學(xué)報(bào)，2019，46（12）：2449-2454.

［3］ 鄭斯斯，李穎，黃清俊，等.殼斗科植物葉片高純度基因組DNA提取方法的優(yōu)化［J］.分子植物育種，2020，18（20）：6725-6733.

［4］ 黃恒，王曉麗.采用CTAB與SDS法提取白術(shù)DNA的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）：2860-2861.

［5］ 王志安，徐行，沈曉霞，等.白術(shù)種質(zhì)AFLP指紋圖譜分析體系的建立和應(yīng)用［J］.中藥材，2008，31（4）：483-487.

［6］ 曹亮，蔣超，彭華勝，等.白術(shù)、蒼術(shù)種子位點(diǎn)特異性PCR鑒別方法研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（16）：2567-2570.

［7］ 余亞?wèn)|，石林春，馬曉沖，等.白術(shù)與蒼術(shù)及其混偽品DNA條形碼鑒定研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2014，39（12）：2194-2198.

［8］ 馬輝，張智俊，羅淑萍，等.藥用植物白術(shù)DNA提取方法的研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（2）：13-16.

［9］ 王景雪，孫毅，高武軍.一種簡(jiǎn)便實(shí)用的植物總DNA提取方法［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，23（3）：271-272.

［10］ 謝景梅，劉曉蘭，曲存民，等.甘藍(lán)型油菜成熟籽粒DNA快速提取方法探討［J］.作物雜志，2012（1）：17-21.

［11］ 王惠，郭峰，關(guān)超，等.適用于SSR分析的半粒水稻干種子DNA快速提?。跩］.科技導(dǎo)報(bào)，2013，31（25）：58-60.

［12］ 丁海燕，丁晨.小麥籽粒DNA提取方法的比較及SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究［J］.麥類作物學(xué)報(bào)，2016，36（3）：287-291.

［13］ 董永軍，王陸軍，郝建平，等.玉米干種子基因組DNA提取方法的改進(jìn)［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（12）：1903-1906.

［14］ BURAGOHAIN J，KONWAR B K.An efficient and reliable method of DNA extraction from Meyna spinosa-A traditional medicinal plant from north-east India［J］.Journal of plant biochemistry & biotechnology，2008，17（1）：103-105.

［15］ 夏玲，梁昕景，王學(xué)林，等.甜瓜半粒干種子DNA提取方法的優(yōu)化［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，50（7）：1426-1431.

［16］ 占塔鵬，黃舒婷，喬柱，等.山豆根基因組DNA高效提取方法的建立與優(yōu)化［J］.分子植物育種，2020，18（8）：2585-2590.

［17］ ABOUL-MAATY N A F，ORABY H A S.Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method［J］.Bulletin of the national research centre，2019，43（1）：1-10.