郭淑芬 吳嘉惠 劉伯言 陳文文 耿 彪 劉志超

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,泰安,271000

銀屑病是一種常見的免疫介導(dǎo)的以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、異常分化及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的慢性炎癥性皮膚病,全球發(fā)病率為0.1%～3%[1,2]。在銀屑病中,以T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)于皮膚局部,釋放白細(xì)胞介素(IL)-17A、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-23、IL-1β、IL-6等大量炎癥因子促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖,而過度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)而釋放大量的細(xì)胞因子和趨化因子,以維持和放大炎癥反應(yīng)[3-5]。因此,減弱角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖或/和炎癥因子表達(dá)的策略被認(rèn)為是銀屑病潛在的治療手段。

氫氣(H2)是一種無色、無味且具有還原性的氣體,其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,分子量小,易于擴(kuò)散,容易進(jìn)入機(jī)體各部位。大量研究已經(jīng)證實(shí)氫氣對(duì)炎癥性疾病有調(diào)控作用,在大多數(shù)炎癥模型中,H2通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的水平來發(fā)揮抗炎作用[6,7,8]。我們前期探索性結(jié)果表明:氫氣干預(yù)治療斑塊狀銀屑病,PASI75及 PASI90 應(yīng)答率較傳統(tǒng)治療明顯提高,肝腎功能未受影響,起到了良好的輔助治療作用。據(jù)此,我們提出以下假說:氫氣可能通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá),抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及異常分化,從而起到治療銀屑病的作用。

HaCaT細(xì)胞是人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞,為進(jìn)一步探索氫氣作用于銀屑病的靶點(diǎn)及可能機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以IL-17A、IL-22、腫瘤抑制素M、IL-1α和TNF-α的混合物M5[9]刺激HaCaT細(xì)胞,建立銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖及炎癥因子表達(dá)模型,探討氫氣對(duì)其影響,并與阿維A的作用進(jìn)行對(duì)比分析,為氫氣治療銀屑病提供科學(xué)理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HaCaT細(xì)胞、HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基(MEM+15%FBS+1%P/S Solution)、胎牛血清購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司,阿維A、胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司,IL-17A、IL-22、腫瘤抑制素M、IL-1α和TNF-α購(gòu)自美國(guó)ProSpec公司,CCK-8試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技有限公司,TRIzol試劑、HiFiScript cDNA Synthesis Kit(cDNA合成試劑盒)和UltraSYBR Mixture(實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒)購(gòu)自北京世紀(jì)康為生物科技有限公司。SpectraMax i3x多功能熒光酶標(biāo)儀來自美國(guó)Molecular Devices公司,QuantStudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀來自美國(guó)ThermoFisher公司,PH-A2氫氣細(xì)胞培養(yǎng)箱來自無錫恒緣生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基中,置于飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后取出96孔板,CCK-8法檢測(cè)各孔吸光度:每孔更換新鮮培養(yǎng)基并加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中反應(yīng)3 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3 氫氣干預(yù)正常HaCaT細(xì)胞 將HaCaT細(xì)胞以15000個(gè)/mL接種至96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,后將細(xì)胞分別放入0%、25%、50%濃度氫氣培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8法檢測(cè)各孔吸光度。

1.2.4 M5誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞過度增殖 將HaCaT細(xì)胞以15000個(gè)/mL接種至96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。后將細(xì)胞培養(yǎng)液分別更換成含有0、2.5、5、10 ng/mL M5的細(xì)胞培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8法檢測(cè)各孔吸光度。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組處理 將HaCaT細(xì)胞以15000個(gè)/mL接種至96孔與6孔培養(yǎng)板(每孔分別為100 μL及3 mL),置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。后將HaCaT細(xì)胞分為4組,Control組用含0 ng/mL M5的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h,Model組用含2.5 ng/mL M5的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h,H2組在Model組基礎(chǔ)上將細(xì)胞放入25%氫氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,Acitretin組在Model組基礎(chǔ)上加10 μmol/L阿維A培養(yǎng)72 h。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)KRT6、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平 培養(yǎng)結(jié)束后取出6孔培養(yǎng)板,按照說明書使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量,PCR儀檢測(cè)樣品的CT值(反應(yīng)過程為95°C預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃延伸1 min,變性延伸共40個(gè)循環(huán)),GAPDH作為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:

KRT6:5′-GGGTTTCAGTGCCAACTCAG-3′ (正向引物)

5′-CCAGGCCATACAGACTGCGG-3′ (反向引物)

IL-1β:5′-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3′ (正向引物)

5′-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA-3′ (反向引物)

IL-6:5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′ (正向引物)

5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′ (反向引物)

TNF-α:5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′ (正向引物)

5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′ (反向引物)

GAPDH:5′-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3′ (正向引物)

5′-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3′ (反向引物)

2 結(jié)果

2.1 氫氣干預(yù)對(duì)正常HaCaT細(xì)胞增殖的影響 為了探究不同氫氣濃度干預(yù)是否影響正常HaCaT細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)了不同氫氣濃度(0%、25%、50%)干預(yù)72 h對(duì)正常HaCaT細(xì)胞增殖的影響。由圖1可知,與無氫氣相比,25%、50%濃度氫氣干預(yù)72 h后細(xì)胞吸光度相對(duì)值分別為(100.51±6.98)%、(103.04±5.22)%,各組之間無顯著差異,表明不同濃度氫氣對(duì)正常HaCaT細(xì)胞無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)選用25%氫氣濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同濃度氫氣干預(yù)72 h后HaCaT細(xì)胞增殖情況 圖2 不同濃度M5誘導(dǎo)不同時(shí)間后HaCaT細(xì)胞增殖情況(**:P<0.01) 圖3 不同干預(yù)方式對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響(**:vs Control,P<0.01;##:vs Model,P<0.01)

2.2 M5誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞過度增殖模型的建立 為了確定建立HaCaT細(xì)胞過度增殖模型的藥物濃度及時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度M5(0、2.5、5、10 ng/mL)對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行24 h、48 h及72 h干預(yù),并用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。由圖2可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各種細(xì)胞增殖活性逐漸提高。在第72 h,與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞相比(M5 0 ng/mL),2.5 ng/mL M5刺激下細(xì)胞增殖顯著提高(P<0.01),由此確定M5的造模濃度及時(shí)間為2.5 ng/mL刺激72 h。

2.3 氫氣干預(yù)對(duì)M5刺激的HaCaT細(xì)胞增殖的影響 由圖3可知,經(jīng)過2.5 ng/mL的M5刺激72 h,細(xì)胞吸光度相對(duì)值顯著提高(Model vs Control,P<0.01),表明HaCaT細(xì)胞過度增殖。與Model組相比,25%氫氣干預(yù)可以顯著降低細(xì)胞吸光度相對(duì)值(P<0.01),抑制HaCaT細(xì)胞過度增殖。與Model組相比,陽性藥物阿維A干預(yù)的Acitretin組也顯著抑制了細(xì)胞增殖(P<0.01)。

2.4 氫氣干預(yù)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖標(biāo)記因子KRT6 mRNA表達(dá)的影響 KRT6被認(rèn)為是角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的標(biāo)記因子[10,11]。如圖4a所示,與Control組相比,Model組KRT6的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.001);與Model相比,25%的氫氣干預(yù)及陽性藥物阿維A干預(yù)對(duì)KRT6 的mRNA表達(dá)具有一定抑制作用(均P<0.001)。

圖4 不同干預(yù)方式對(duì)KRT6、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)水平的影響(*** :vs Control,P<0.001;##:vs Model,P<0.01;###:vs Model,P<0.001)

2.5 氫氣干預(yù)對(duì)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響 IL-1β、IL-6和TNF-α是促進(jìn)銀屑病發(fā)生發(fā)展的炎癥因子[3-5]。與Control組相比,Model組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)均顯著升高(均P<0.001);與Model組相比,25%氫氣干預(yù)對(duì)過度增殖的HaCaT細(xì)胞上述mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)出一定的抑制作用(P<0.01或P<0.001)。陽性對(duì)照藥物阿維A對(duì)相關(guān)炎癥因子的mRNA表達(dá)也起到顯著抑制作用(均P<0.01)。見圖4。

3 討論

銀屑病是一種由多種細(xì)胞介導(dǎo)的復(fù)雜炎癥性皮膚病,包括角質(zhì)形成細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[12]。角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚的結(jié)構(gòu)細(xì)胞,在銀屑病發(fā)病過程中既是參與者又是受害者。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡是維持皮膚穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵,銀屑病發(fā)病過程中,角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡減少,導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖[13,14],過度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞又會(huì)表達(dá)大量的細(xì)胞因子來維持和放大炎癥反應(yīng)[3-5]。

IL-1是天然免疫和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),IL-1β具有促炎效應(yīng),放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與銀屑病的發(fā)生過程[15]。IL-6是調(diào)控多種細(xì)胞因子表達(dá)的重要誘導(dǎo)因子,參與了表皮和真皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[16],IL-6異常升高將導(dǎo)致Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間的平衡紊亂,從而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生[17]。最新研究[18]發(fā)現(xiàn),銀屑病患者血清IL-6濃度與患者的血沉、皮損面積及PASI指數(shù)正相關(guān),且血清IL-6水平高的銀屑病患者更容易發(fā)生關(guān)節(jié)損害,可作為銀屑病炎性活動(dòng)的指標(biāo)。TNF-α在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中處于關(guān)鍵地位,可作為銀屑病潛在的生物標(biāo)志物和治療反應(yīng)指標(biāo)[19],針對(duì)TNF-α進(jìn)行干預(yù)治療銀屑病被證明是有效的,是銀屑病靶向治療的重要策略[20]。因此,減輕角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖或/和炎癥因子表達(dá)是治療銀屑病的熱點(diǎn)之一。

氫氣(H2)是一種安全、無毒的強(qiáng)抗氧化劑,具有選擇性抗炎、抗氧化作用。已有研究表明,H2可通過調(diào)控 NF-κB、MAPK 等信號(hào)通路,降低促炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、干擾素-γ[21]等的釋放而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。而這些信號(hào)通路在銀屑病的發(fā)病中亦起著關(guān)鍵作用。近年來有關(guān)氫氣治療銀屑病的研究不斷報(bào)道。Zhu等報(bào)道,在氫水中洗澡可以顯著改善患者的銀屑病皮損[22]。另一項(xiàng)針對(duì)銀屑病相關(guān)關(guān)節(jié)炎和皮損患者的臨床研究也顯示,氫氣治療后炎癥減輕[23]。氫氣在各種損傷模型中可通過抑制炎癥因子(如L-1β、IL-6、TNF-α等),表現(xiàn)出抗炎活性[24]。因此,氫氣的使用可能成為一種新型的安全的皮膚疾病療法,改善銀屑病皮損,提高患者的生活質(zhì)量。

本研究通過體外試驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn),M5誘導(dǎo)72 h后HaCaT細(xì)胞增殖及KRT6、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)水平明顯升高;氫氣干預(yù)后上述指標(biāo)顯著降低,表明氫氣能夠抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞模型過度增殖及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。

綜上認(rèn)為,氫氣可能是通過抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮治療銀屑病的作用,但其具體機(jī)制及信號(hào)通路有待進(jìn)一步探索。