楊士云，張瑛，喬靜，羅璇

1.北京市公安司法鑒定中心 法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192；2.北京市公安局通州分局刑事偵查支隊，北京 101100

1 案 例

1.1 簡要案情

某男，68 歲，有抑郁癥病史2 年，長期使用艾司唑侖。某日上午，其子陪該男去醫(yī)院開了3 盒艾司唑侖（共60 片，每片1 mg）。11：00 許其子送該男回到小區(qū)門口，30 min 后其子聯(lián)系不上該男，家中也沒發(fā)現(xiàn)在醫(yī)院開的藥物。3 d 后，在距離小區(qū)約500 m 處的河內(nèi)發(fā)現(xiàn)該男尸體，已輕度腐敗，經(jīng)尸表檢查，未發(fā)現(xiàn)可疑中毒現(xiàn)象。行尸體解剖，同時提取心血（20 mL）、胃內(nèi)容物（50 g）、尿液（15 mL）送檢，要求檢驗血液中是否有乙醇和鎮(zhèn)靜催眠藥、胃內(nèi)容物中是否有鎮(zhèn)靜催眠藥、尿液中是否有毒品。經(jīng)尸體檢驗并結(jié)合毒（藥）物檢驗結(jié)果判定該男為溺死。為進一步了解上述毒（藥）物在體內(nèi)的分布情況，繼續(xù)送檢玻璃體液、肝、肺、腎、心、脾、腦、腹壁肌肉和頭發(fā)檢材。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑和儀器

LC-Q ExactiveTMHF 組合型 四 極 桿Orbitrap 高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），GL-21M 高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），AL104 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司），VORTEX 2 渦旋混勻器（德國IKA 公司），JXFSTPRP-24 組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），孔徑為0.22 μm 的有機系針式過濾器（北京八方世紀科技有限公司），Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

艾司唑侖標準物質(zhì)（10 mg，99.0%），乙腈、甲醇、甲酸和甲酸胺（色譜純，德國Merck 公司），超純水由Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)制備。

1.2.2 樣品及標準品

樣品為本例尸體的心血、胃內(nèi)容物、尿液、玻璃體液、肝、肺、腎、心、脾、腦、腹壁肌肉和頭發(fā)。

選擇日常受理的1 例經(jīng)鑒定明確為猝死且常規(guī)毒（藥）物檢驗為陰性的心血和肝組織作為空白對照，添加標準物質(zhì)進行質(zhì)量控制。

1.2.3 前處理方法

心血、尿液、玻璃體液各取0.5 mL，加入1 mL 甲醇乙腈溶液（甲醇體積分數(shù)為20%）；各器官（肝、肺、腎、心、脾、腦）及腹壁肌肉組織勻漿，各取0.5 g，加入1 mL 甲醇乙腈溶液。所有樣品超聲振蕩10 min，以離心半徑8.2 cm，14 000 r/min，離心10 min，上清液經(jīng)有機系針式過濾器過濾后行液相色譜-高分辨質(zhì)譜（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）分析。

胃內(nèi)容物取0.1 mL，加入0.9 mL甲醇乙腈溶液，渦旋振蕩1 min，在4 ℃下，以離心半徑8.2 cm，14 000 r/min，離心10 min，取上清液0.1 mL，加入0.9 mL甲醇乙腈溶液混勻，經(jīng)有機系針式過濾器過濾后行LC-HRMS 分析。

頭發(fā)依次用水、洗潔精、水沖洗干凈后晾干，剪成1 cm左右的小段。稱取2份，一份0.1 g，一份0.2 g，分別用研磨儀研碎，加入1.5 mL 甲醇超聲提取1 h，然后在4 ℃下，以離心半徑8.2 cm，14 000 r/min，離心10 min，取上清液經(jīng)有機系針式過濾器過濾后行LC-HRMS分析。

取0.5 mL 空白血液若干份、0.5 g 空白肝組織若干份，分別加入30、50、100、200、500、1 000 ng 艾司唑侖，每個濃度點同時添加兩個樣品，平行操作。將樣品渦旋混合均勻后，與未添加標準物質(zhì)的空白血液均加入1 mL 甲醇乙腈溶液，超聲振蕩10 min，在4 ℃下，以離心半徑8.2 cm，14 000 r/min，離心10 min，上清液經(jīng)有機系針式過濾器過濾后行LC-HRMS 分析。此操作與實驗樣品同時進行。

1.2.4 乙醇、毒品及鎮(zhèn)靜催眠藥的分析方法

按照檢驗要求，用頂空氣相色譜法進行血液中乙醇的檢驗；用酶免疫分析技術(shù)對尿液中常見毒品進行分析；針對鎮(zhèn)靜催眠藥，胃內(nèi)容物和血液經(jīng)乙酸乙酯液液提取濃縮后進行GC-MS 分析，經(jīng)甲醇乙腈溶液沉淀蛋白后進行LC-HRMS 分析。其他檢材經(jīng)甲醇乙腈溶液沉淀蛋白后進行LC-HRMS 分析。

1.2.5 實驗條件

色譜條件：ACQUITY UPLC HSS C18 色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm；美國Waters 公司）。流動相A 為2 mmol 甲酸銨、0.01%的甲酸水溶液，流動相B 為甲醇，梯度洗脫，共19 min。洗脫程序：0～0.5 min 10%B，0.5～5.5 min 10%B～45%B，5.5～9.5 min 45%B，9.5～13.0 min 45%B～90%B，13.0～16.5 min 90%B，16.5～19.0 min 10%B。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧電離（heated electrospray ionization，HESI）正離子模式，噴霧電壓3.8 kV，電子能量為30、50、90 eV，離子源溫度320 ℃，傳輸線溫度350 ℃，采用一級全掃描和數(shù)據(jù)依賴二級掃描模式（Full mass/ddMS2），質(zhì)量分辨率60 000，自動增益控制（automatic gain control，AGC）為106，掃描范圍為m/z100～1 000。

1.3 檢驗結(jié)果

經(jīng)毒（藥）物檢驗，在該男心血中未檢出乙醇成分，尿液中未檢出苯丙胺類、大麻類、嗎啡、氯胺酮、可卡因等常見毒品，心血、胃內(nèi)容物、尿液、玻璃體液、肌肉、頭發(fā)及各器官中均檢出艾司唑侖成分，含量分別為：尿液0.05 μg/mL，血液0.24 μg/mL，胃內(nèi)容物7.53 μg/g，腦0.45 μg/g，腎0.58 μg/g，肺1.08 μg/g，玻璃體液0.11 μg/mL，肝2.35 μg/g，心臟0.45 μg/g，脾1.73 μg/g，肌肉0.41 μg/g，頭發(fā)0.32 μg/g。此外，在心血、肝、肺、腎、心、脾、腦和腹壁肌肉中出現(xiàn)疑似羥基艾司唑侖的準分子離子峰，在尿液、胃內(nèi)容物、玻璃體液、頭發(fā)中未出現(xiàn)羥基艾司唑侖的準分子離子峰。肝組織中艾司唑侖及其代謝物羥基艾司唑侖的相關(guān)譜圖見圖1～3。

圖1 肝組織中艾司唑侖及羥基艾司唑侖的色譜圖Fig.1 Chromatograms of estazolam and hydroxyestazolam in liver

圖2 肝組織中艾司唑侖的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of estazolam in liver

圖3 肝組織中羥基艾司唑侖的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of hydroxyestazolam in liver

2 討論

艾司唑侖又名舒樂安定，屬于苯二氮?類鎮(zhèn)靜催眠藥，是臨床上應(yīng)用非常廣泛的一種藥物，可用于各種類型的失眠，其作用時間適中，催眠作用強，口服后20～60 min 可入睡，維持5 h，在臨床上被廣泛用于抗焦慮、緩解術(shù)前緊張以及抗癲癇、抗驚厥等方面，還可用于緊張性頭痛。由于艾司唑侖使用廣泛，由此引起的不良事件時有發(fā)生，麻醉后搶劫、強奸以及中毒和死亡的案件頻發(fā)[1-3]。由于檢材的不易獲得性，國內(nèi)對艾司唑侖的研究多為血液和尿液。本例除了對血液和尿液進行分析外，還對艾司唑侖在體內(nèi)器官中的分布進行了研究。2016 年，LIU 等[4]對一起采用艾司唑侖和海洛因殺人的案件進行了分析，在死者體內(nèi)檢出6-單乙酰嗎啡、嗎啡和艾司唑侖成分，并對這3種物質(zhì)在體內(nèi)的分布進行了分析，艾司唑侖在肝組織中聚集（1 080 ng/g），在血液中質(zhì)量濃度為797 ng/mL，其次是肺、腎、肌肉、心肌和腦，最后此案的死因被確定為與濫用毒品相關(guān)。本例死者生前服用了艾司唑侖，血液中艾司唑侖質(zhì)量濃度為0.24 μg/mL，低于已報道的中毒質(zhì)量濃度（1.25 μg/mL）[5]，高于治療質(zhì)量濃度（0.055～0.2 μg/mL）[5]；而在胃內(nèi)容物中質(zhì)量濃度為7.53 μg/g，說明死者在服用艾司唑侖后不久便死亡，藥物尚未被完全吸收；頭發(fā)和肌肉中均檢出艾司唑侖，證實死者長期使用該藥物。此外，在肝組織中還檢出了艾司唑侖的代謝物羥基艾司唑侖。本例法醫(yī)判定的死亡原因為溺死，與此檢驗結(jié)果及案情吻合。尸體在水中浸泡3 d，不排除存在藥物再分布現(xiàn)象。本例中，從體內(nèi)分布結(jié)果來看，檢驗艾司唑侖的較佳檢材是血液、胃內(nèi)容物、肝組織和脾組織，但其體內(nèi)分布與服藥時間、死亡時間密切相關(guān)。

本例在定性分析中，為防止漏檢、保證藥物均能有效檢出，采用了液液提取、濃縮、復溶的模式；而在定量分析中，直接采用甲醇乙腈溶液（甲醇體積分數(shù)為20%）沉淀蛋白，離心、過有機系針式過濾器后直接用于定量分析，減少了實驗環(huán)節(jié)，使藥物定量更準確。