杜文峰，周玲，李琪

肺癌發(fā)病率高、死亡率高，已成為全球腫瘤相關(guān)死亡的主要因素［1］。肺癌包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌，其中85%的肺癌病例被診斷為NSCLC［2］。在過去的幾十年里，全球在NSCLC的預(yù)防、診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展［3］。之前由于篩查方案不完善，臨床癥狀發(fā)現(xiàn)較晚，NSCLC患者確診時大多處于中晚期，預(yù)后較差，5年生存率低于20%［4］。近期發(fā)現(xiàn)的肺癌多為超早期，說明肺癌的早期診斷技術(shù)在不斷提高，但依然有不少患者不能在超早期被確診［5］。因此，尋找早期診斷標(biāo)志物和新的、有效的NSCLC治療方法勢在必行。有研究顯示，部分環(huán)狀RNA（CircRNAs）異常表達(dá)與包括NSCLC 在內(nèi)的肺癌等腫瘤發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)［6-7］。越來越多的證據(jù)表明，CircRNAs 反義小腦變性相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄本（CircRNA antisense cerebellar degenerationrelated protein 1 transcript，CircCDR1as）可促進(jìn)前列腺癌［8］和胰腺癌［9］，抑制膀胱癌［10］和卵巢癌［11］的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，CircCDR1as 作為一種致癌基因，促進(jìn)了NSCLC 的發(fā)展［12］。然而，CircCDR1as 參與NSCLC進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。StarBase 預(yù)測顯示CircCDR1as 可能調(diào)控miR-671-5p 表達(dá)。既往研究表明，沉默miR-671-5p 表達(dá)可促進(jìn)NSCLC 的進(jìn)展［13］。此外，多梳蛋白（polycomb group，PcG）家族在人類癌癥進(jìn)展的多個過程中至關(guān)重要［14］。染色盒同源物4（chromobox 4，CBX4）是PcG 家族表觀遺傳調(diào)控因子中的一員，可能驅(qū)動肺癌的惡性進(jìn)展［15］。既往研究表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CBX4是miR-671-5p的靶基因，且過表達(dá)CBX4 能夠逆轉(zhuǎn)miR-671-5p 上調(diào)對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的抑制作用［16］，但是在NSCLC細(xì)胞中是否有同樣的調(diào)控作用還不清楚。本研究探討了CircCDR1as 在NSCLC 中的生物學(xué)功能及其與miR-671-5p 和CBX4 的關(guān)系，為深入了解NSCLC 進(jìn)展的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 CircCDR1as、CBX4 過表達(dá)載體及其陰性對照pcDNA3.1 載體（pcDNA），CircCDR1as 小干擾RNA（si-CircCDR1as）及陰性對照（si-NC）、miR-671-5p mimic 及陰性對照（miR-NC）、miR-671-5p inhibitor（anti-miR-671-5p）及陰性對照（anti-NC）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。DMEM 培養(yǎng)基、Trizol 試劑購自Sigma-Aldrich；RNase R 購自Abcam 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒、BCA 蛋白測定試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液、二甲基亞砜、結(jié)晶紫、硝酸纖維素膜購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SYBR Green、甲醇、Lipofectamine 3000 及兔抗人CBX4、GAPDH 抗體、山羊抗兔IgG 二抗（HRP）購自美國Thermo Fisher；總蛋白提取試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Western 阻斷緩沖液購自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；Transwell嵌套24 孔板購自上海凌儀生物科技有限公司；Matrigel 膠購自北京萌壯科技有限公司；Annexin V-熒光素異硫氰酸鹽（FITC）和碘化丙啶（PI）購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶測定系統(tǒng)購自Promega。酶標(biāo)儀購自北京普天新橋技術(shù)有限公司；顯微鏡購自奧林巴斯；流式細(xì)胞儀購自艾力特生命科學(xué)（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人支氣管上皮樣細(xì)胞（HBE）和人NSCLC細(xì)胞株（NCI-H524、NCI-H1734、Calu-3和A549）購自上海ATCC細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 3000對A549細(xì)胞進(jìn)行24 h 的寡核苷酸或載體轉(zhuǎn)染，并分成Control 組（正常培養(yǎng)）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-CircCDR1as 組（轉(zhuǎn)染si-CircCDR1as）、si-CircCDR1as+anti-miR-NC 組（共轉(zhuǎn)染si-CircCDR1as和anti-miR-NC）、si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組（共轉(zhuǎn)染si-CircCDR1as和anti-miR-671-5p）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA）、CircCDR1as 組（轉(zhuǎn)染CircCDR1as）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-671-5p組（轉(zhuǎn)染miR-671-5p）、miR-671-5p+pcDNA 組（共轉(zhuǎn)染miR-671-5p 和pcDNA）、miR-671-5p+CBX4 組（共轉(zhuǎn)染miR-671-5p 和CBX4）、anti-miRNC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）和anti-miR-671-5p 組（轉(zhuǎn)染antimiR-671-5p）。

1.2.2 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測CircCDR1as、miR-671-5p和CBX4 mRNA表達(dá)水平 用Trizol試劑裂解細(xì)胞，分離總RNA。提取CircRNA 時，RNA 經(jīng)RNase R 進(jìn)一步處理，利用cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)DNA（cDNA），與SYBR Green和特異性引物混合后用于qRT-PCR檢測。CircCDR1as 引物正向5'-CCCAGTCTTCCATCAACTGG-3'，反向5'-ACCTTGACACAGGTGCCATC-3'，196 bp；CBX4 引物正向5'-TGGAGTATCTGGTGAAATGGA-3'；反向5'-ACGACGGGCAAAGGTAGGCAC-3'，218 bp；miR-671-5p引物正向5'-AGGAAGCCCTGGAGG-3'，反向5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3' ，207 bp；GAPDH 引物正向5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'，反向5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，235 bp；U6引物正向5'-AAAGCAAATCATC-GGACGACC-3'，反向5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'，224 bp。PCR 反應(yīng)體系：cDNA 5μL，SYBR Green 10μL，正、反向引物各0.4 μL，H2O 4.2 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃15 s，共38 個循環(huán)。GAPDH 或U6 作為內(nèi)部對照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.3 Western blot 分析CBX4 蛋白的相對表達(dá) 用總蛋白提取試劑盒制備蛋白樣品，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，98 ℃變性10 min。對等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE和硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移。用Western阻斷緩沖液阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，用CBX4 或GAPDH 一抗和相應(yīng)二抗孵育膜，化學(xué)發(fā)光試劑顯色。采用Quantity One 軟件，以GAPDH 為內(nèi)參，對灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因分析驗(yàn)證miR-671-5p 與CircCDR1as 或CBX4 的關(guān)系 通過StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測miR-671-5p 與CircCDR1as 或CBX4 的潛在結(jié)合位點(diǎn)。克隆含有miR-671-5p 結(jié)合位點(diǎn)的CircCDR1as 或CBX4 3'-UTR 序列，然后將其連接至psiCHECK-2 雙熒光素酶載體上，生成野生型熒光素酶報告基因載體（CircCDR1as-WT 和CBX4-WT）和相應(yīng)的突變體（CircCDR1as-MUT 和CBX4-MUT）。然后，將構(gòu)建的熒光素酶報告基因載體和miR-671-5p 或miR-NC 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，用雙熒光素酶測定系統(tǒng)測定螢火蟲和海腎的熒光素酶活性。各組螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)組相對熒光素酶活性歸一化為對照組。

1.2.5 MTT 實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染后，收集A549 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×104個/mL。于96 孔板中加入細(xì)胞懸液（100 μL/孔），分別培養(yǎng)0、1、2、3 d。在指定的時間點(diǎn)，添加MTT溶液（10μL/孔）再孵育4 h。然后除去培養(yǎng)基，每孔加入100μL 二甲基亞砜溶解晶體，通過酶標(biāo)儀測定490 nm 波長下的光密度（OD）值。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖能力 A549 細(xì)胞（每孔300 個細(xì)胞）接種于6 孔板。培養(yǎng)10 d 后，用甲醇固定細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)克隆形成情況。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡 A549 細(xì)胞（每孔1×105個）接種于24 孔板，培養(yǎng)3 d。將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，用5μL FITC和PI避光染色10 min。流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞。凋亡率以右上、下象限細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.2.8 Transwell法評價細(xì)胞遷移、侵襲 采用Transwell嵌套24 孔板測試其遷移和侵襲能力。Transwell 小室上室預(yù)涂Matrigel 膠用于侵襲實(shí)驗(yàn)，未處理的Transwell 小室用于遷移實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后，用無血清DMEM 制備3×105個/mL 的A549 細(xì)胞懸液，并將100μL的細(xì)胞懸液放入上室。下室加入含10%血清的DMEM。孵育24 h 后，將遷移或侵襲的細(xì)胞固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，然后在100倍顯微鏡下選取3個視野觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 細(xì)胞中CircCDR1as、CBX4 表達(dá)上調(diào)，miR-671-5p 表達(dá)下調(diào) 與HBE 細(xì)胞相比，CircCDR1as 在4 種NSCLC 細(xì)胞系中的表達(dá)增加，miR-671-5p 表達(dá)降低，CBX4 mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.05），見圖1、表1。且A549細(xì)胞中CircCDR1as的表達(dá)最高（F=328.965，P＜0.05），故選擇該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab.1 CircCDR1as,miR-671-5p and CBX4 levels in HBE cells and NSCLC cell lines表1 HBE細(xì)胞和NSCLC細(xì)胞系中CircCDR1as、miR-671-5p、CBX4表達(dá)水平 （n=6，）

Tab.1 CircCDR1as,miR-671-5p and CBX4 levels in HBE cells and NSCLC cell lines表1 HBE細(xì)胞和NSCLC細(xì)胞系中CircCDR1as、miR-671-5p、CBX4表達(dá)水平 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與HBE比較，P＜0.05。

細(xì)胞系HBE NCI-H524 NCI-H1734 Calu-3 A549 F CircCDR1as 1.00±0.01 3.92±0.14a 4.09±0.21a 4.15±0.19a 4.29±0.28a 328.965＊＊miR-671-5p 1.00±0.02 0.59±0.05a 0.52±0.06a 0.41±0.04a 0.32±0.02a 243.424＊＊CBX4 mRNA 1.00±0.02 2.86±0.14a 2.95±0.18a 3.18±0.23a 3.32±0.25a 160.266＊＊CBX4蛋白1.00±0.03 2.54±0.11a 2.63±0.14a 2.75±0.21a 2.89±0.16a 175.065＊＊

Fig.1 CBX4 protein expression in HBE cells and NSCLC cell lines圖1 HBE細(xì)胞和NSCLC細(xì)胞系中CBX4蛋白的表達(dá)

2.2 CircCDR1as 在NSCLC 細(xì)胞中靶向調(diào)控miR-671-5p CircCDR1as 和miR-671-5p 的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)見圖2。與miR-NC+CircCDR1as-WT 組相比，miR-671-5p+CircCDR1as-WT 組相對熒光素酶活性降低（1.00±0.02vs.0.39±0.01，n=6，t=66.822，P＜0.05）；miR-NC+CircCDR1as-MUT 組與miR-671-5p+CircCDR1as-MUT 組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（1.00±0.01vs.1.02±0.04，n=6，t=1.188，P＞0.05）。此外，在A549細(xì)胞中，與pcDNA組相比，CircCDR1as 組miR-671-5p 表達(dá)降低（1.00±0.03vs.0.36±0.02，n=6，t=43.479，P＜0.05）；與si-NC 組相比，si-CircCDR1as 組miR-671-5p 表達(dá)升高（1.01±0.05vs.2.14±0.11，n=6，t=22.907，P＜0.05）。

Fig.2 The binding sites of CircCDR1as and miR-671-5p predicted by starBase圖2 通過starBase預(yù)測CircCDR1as和miR-671-5p的結(jié)合位點(diǎn)

2.3 miR-671-5p的敲低可減弱CircCDR1as沉默對NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 與Control 組和si-NC組相比，si-CircCDR1as組CircCDR1as表達(dá)降低，miR-671-5p 表達(dá)升高，細(xì)胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，凋亡率增高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與si-CircCDR1as 組、si-CircCDR1as+antimiR-NC 組相比，si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組CircCDR1as 表達(dá)升高，miR-671-5p 表達(dá)下降，細(xì)胞活力增高，克隆形成數(shù)增多，凋亡率降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），見圖3、表2。

Tab.2 Comparison of NSCLC cell viability,number of clone formation,apoptosis rate,migration and number of invasive cells between the five groups表2 各組NSCLC細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of NSCLC cell viability,number of clone formation,apoptosis rate,migration and number of invasive cells between the five groups表2 各組NSCLC細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與si-NC組比較，c與si-CircCDR1as組比較，d與si-CircCDR1as+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別Control組si-NC組si-CircCDR1as組si-CircCDR1as+anti-miR-NC組si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組F CircCDR1as 1.00±0.03 1.00±0.02 0.38±0.03ab 0.39±0.02 0.91±0.05cd 611.941＊＊miR-671-5p 1.00±0.02 0.99±0.03 1.78±0.06ab 1.75±0.08 1.26±0.05cd 328.761＊＊細(xì)胞活力（OD490值）1.18±0.21 1.17±0.19 0.49±0.07ab 0.47±0.06 0.99±0.12cd 36.693＊＊克隆形成數(shù)（個）91.45±7.62 91.38±7.49 38.62±3.51ab 38.67±3.48 80.59±6.72cd 121.564＊＊凋亡率（%）10.02±0.91 10.01±0.89 33.45±2.62ab 33.48±2.14 14.13±1.06cd 315.182＊＊遷移細(xì)胞數(shù)（個）94.38±8.12 94.29±7.91 40.15±10.03ab 40.18±10.06 79.84±9.21cd 55.305＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)（個）97.56±6.89 97.54±6.85 41.32±8.74ab 41.35±6.95 80.69±7.24cd 90.091＊＊

Fig.3 Apoptosis,migration and invasion of NSCLC cells in each group(crystal violet staining,×200)圖3 各組NSCLC細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

2.4 CBX4 是miR-671-5p 在NSCLC 細(xì)胞中的靶點(diǎn) StarBase 預(yù)測結(jié)果顯示miR-671-5p 與CBX4 有潛在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。與miR-NC+CBX4-WT組相比，miR-671-5p+CBX4-WT組相對熒光素酶活性降低（1.00±0.03vs.0.41±0.02，n=6，t=40.083，P＜0.05）；miR-671-5p+CBX4-MUT 組與miR-NC+CBX4-MUT組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（1.02±0.03vs.1.00±0.05，n=6，t=0.840，P＞0.05）。此外，miR-671-5p 組與miR-NC 組相比，CBX4 的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05）；anti-miR-671-5p組與anti-miR-NC 組相比，CBX4的mRNA 和蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05），見圖5、表3。

Tab.3 Comparison of mRNA and protein levels of CBX4 in A549 cells between the four groups表3 各組A549細(xì)胞中CBX4的mRNA和蛋白水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of mRNA and protein levels of CBX4 in A549 cells between the four groups表3 各組A549細(xì)胞中CBX4的mRNA和蛋白水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與miR-NC組比較，b與anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別miR-NC組miR-671-5p組anti-miR-NC組anti-miR-671-5p組F CBX4 mRNA 1.00±0.01 0.38±0.04a 1.00±0.02 2.12±0.06b 2 212.351＊＊CBX4蛋白1.00±0.03 0.42±0.04a 1.00±0.02 1.71±0.08b 719.376＊＊

Fig.5 CBX4 protein expression in A549 cells of each group圖5 各組A549細(xì)胞中CBX4蛋白表達(dá)

Fig.4 The binding sites of miR-671-5p and CBX4 predicted by StarBase圖4 StarBase預(yù)測miR-671-5p和CBX4的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 miR-671-5p 通過降低NSCLC 細(xì)胞中CBX4 抑制細(xì)胞活力、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡 與miR-NC組和Control 組相比，miR-671-5p 組CBX4 mRNA 和蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，凋亡率增高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與miR-671-5p 組、miR-671-5p+pcDNA 組相比，miR-671-5p+CBX4 組CBX4 mRNA 和蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活力增高，克隆形成數(shù)增多，凋亡率降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），見圖6、7，表4。

Tab.4 Comparison of NSCLC cell viability,number of clone formation,apoptosis rate,migration and number of invasive cells between the five groups表4 各組NSCLC細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與miR-NC組比較，c與miR-671-5p組比較，d與miR-671-5p+pcDNA組比較，P＜0.05。

組別Control組miR-NC組miR-671-5p組miR-671-5p+pcDNA組miR-671-5p+CBX4組F CBX4 mRNA 1.00±0.02 0.99±0.03 0.36±0.03ab 0.37±0.02 0.84±0.05cd 613.941＊＊CBX4蛋白1.00±0.03 1.01±0.05 0.33±0.02ab 0.32±0.04 0.81±0.05cd 455.051＊＊細(xì)胞活力（OD值）1.09±0.15 1.07±0.13 0.46±0.05ab 0.48±0.06 1.03±0.11cd 55.276＊＊克隆細(xì)胞數(shù)97.68±5.49 97.75±5.63 39.54±2.16ab 39.57±2.13 82.36±4.25cd 297.408＊＊凋亡率（%）8.24±0.13 8.26±0.15 34.52±2.31ab 34.39±2.46 13.64±1.02cd 441.727＊＊遷移細(xì)胞數(shù)86.34±3.52 86.38±3.61 40.15±2.03ab 40.19±2.05 81.23±3.12cd 412.551＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)78.69±2.63 78.72±2.62 35.42±1.89ab 35.51±1.92 67.49±2.01cd 585.024＊＊

Fig.6 Expression of CBX4 protein in A549 cells of each group圖6 各組A549細(xì)胞中CBX4蛋白表達(dá)

Fig.7 Apoptosis,migration and invasion of NSCLC cells in each group(crystal violet staining,×200)圖7 各組NSCLC細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

2.6 沉默CircCDR1as通過調(diào)控miR-671-5p來降低NSCLC 細(xì)胞中CBX4 的表達(dá) 與Control 組和si-NC組相比，si-CircCDR1as 組CBX4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與si-CircCDR1as 組、si-CircCDR1as+anti-miR-NC 組相比，si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組CBX4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05），見圖8、表5。

Tab.5 Comparison of CBX4 expression in NSCLC cells between the five groups表5 各組NSCLC細(xì)胞CBX4表達(dá)的比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of CBX4 expression in NSCLC cells between the five groups表5 各組NSCLC細(xì)胞CBX4表達(dá)的比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與si-NC組比較，c與si-CircCDR1as組比較，d與si-CircCDR1as+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別Control組si-NC組si-CircCDR1as組si-CircCDR1as+anti-miR-NC組si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組F CBX4 mRNA 1.00±0.03 1.02±0.05 0.43±0.03ab 0.41±0.02 0.82±0.06cd 322.880＊＊CBX4蛋白1.00±0.02 1.01±0.03 0.49±0.05ab 0.50±0.07 0.87±0.09cd 121.304＊＊

Fig.8 CBX4 protein expression in A549 cells of each group圖8 各組A549細(xì)胞中CBX4蛋白表達(dá)

3 討論

CircRNAs 在癌細(xì)胞中異常表達(dá)，可能是癌癥診斷和治療的潛在靶點(diǎn)［17］。由于腫瘤微環(huán)境的改變，CircCDR1as可以在不同的癌癥中作為致癌或抑癌基因發(fā)揮作用［8-11］。Zhang 等［12］報道了CircCDR1as 在NSCLC 中的異常表達(dá)。然而，CircCDR1as 在NSCLC發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確。本研究在體外驗(yàn)證了CircCDR1as 基因沉默對NSCLC 發(fā)展的抑制作用并揭示了CircCDR1as/miR-671-5p/CBX4 在NSCLC 細(xì)胞中的調(diào)節(jié)機(jī)制。

CircRNAs 在肺癌的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CircCDR1as在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，提示CircCDR1as 高表達(dá)可能導(dǎo)致NSCLC的惡性進(jìn)展。腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是肺癌惡性進(jìn)展的兩個關(guān)鍵調(diào)控因素［18］。為了探討CircCDR1as在NSCLC治療中的潛在價值，本研究通過功能缺失實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CircCDR1as沉默可抑制NSCLC細(xì)胞活力，減少克隆形成數(shù)和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞凋亡率，這與既往Zhang 等［12，19］的報道相似，提示CircCDR1as 沉默在NSCLC 細(xì)胞中發(fā)揮抗癌作用。上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是調(diào)節(jié)肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制［20］。因此，CircCDR1as 可否通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移和侵襲還有待進(jìn)一步研究。

CircRNAs 可以作為miRNAs的“海綿”參與癌癥的發(fā)展［21］。一些報道已經(jīng)證明CircCDR1as 可以通過調(diào)節(jié)下游miRNA 的水平來調(diào)控腫瘤進(jìn)展的過程［11，22］。此前的研究發(fā)現(xiàn)，CircCDR1as 通過吸附miR-671-5p 促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞自噬［23］。與此一致的是，本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測證實(shí)CircCDR1as在NSCLC細(xì)胞中是miR-671-5p的“海綿”。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-671-5p 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)下降，其過表達(dá)抑制了NSCLC 細(xì)胞活力，降低了克隆形成數(shù)和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)，升高了細(xì)胞凋亡率，這也與之前的研究［24］一致。這表明miR-671-5p在NSCLC中的抗癌作用。此外，本研究數(shù)據(jù)顯示，CircCDR1as沉默對NSCLC 進(jìn)展的抑制作用被miR-671-5p抑制劑削弱，揭示了CircCDR1as可能通過海綿吸附miR-671-5p 促進(jìn)NSCLC 發(fā)展的可能性。

為了進(jìn)一步闡明CircCDR1as 的作用機(jī)制，本研究分析了miR-671-5p 的靶點(diǎn)。以往的研究已經(jīng)證實(shí)miR-671-5p 在不同條件下具有多種靶點(diǎn)，如MFAP3L、TUFT1 等［12，25］。本研究證實(shí)了miR-671-5p 和CBX4 在NSCLC 細(xì)胞中的靶向關(guān)系。CBX4 是一種SUMO E3連接酶，也被稱為HPC2，其作為一種相對保守的PcG 蛋白，參與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞周期調(diào)控［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，CBX4 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)增加，提示CBX4 的高表達(dá)可能促進(jìn)了NSCLC 的發(fā)生發(fā)展，這與Hu等［15］的研究結(jié)果類似。在常氧條件下，CBX4 在乳腺癌［27］和胃癌［28］等多種腫瘤中具有促增殖、促轉(zhuǎn)移和抑凋亡作用。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)CBX4 的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，與之前的研究［15］一致。同時，本研究結(jié)果顯示，CBX4 逆轉(zhuǎn)了miR-671-5p 對NSCLC 進(jìn)展的抑制作用，提示miR-671-5p 通過靶向CBX4 抑制NSCLC 進(jìn)展。 此外，本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CircCDR1as 可以通過調(diào)控miR-671-5p 在NSCLC 細(xì)胞中水平來降低CBX4的表達(dá)。由于體外細(xì)胞培養(yǎng)條件不能完全模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，后續(xù)研究應(yīng)利用小鼠肺癌模型進(jìn)行臨床前分析。

綜上所述，CircCDR1as 在NSCLC 細(xì)胞中均高表達(dá)。沉默CircCDR1as可能通過上調(diào)miR-671-5p、降低CBX4表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制NSCLC 的進(jìn)展，這可能有助于深入了解NSCLC惡性進(jìn)展的機(jī)制。