朱玉婷，晏文△，應(yīng)理晟，王進京

銀屑病是一種常見且易復(fù)發(fā)的慢性、炎癥性皮膚病，全世界有超過1.25億人受累［1］。目前，銀屑病的確切病因及發(fā)病機制尚未完全明確，但多數(shù)研究認為腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［2］、白細胞介素（interleukin，IL）-17［3］及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）［4］等細胞因子在其發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是從川芎中提取的一種生物活性單體，屬酰胺類生物堿。研究顯示，TMP可降低TNF-α、IL-17、VEGF 等細胞因子的表達，對多種內(nèi)科疾病均有療效［5-7］。因此，筆者推測川芎嗪對銀屑病的治療可能有類似的作用機制。本研究以細胞因子TNF-α、IL-17、VEGF 為切入點，探討TMP對咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損的治療作用機制，以期為川芎嗪治療銀屑病提供動物實驗依據(jù)，為銀屑病的治療提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級BALB/c小鼠，雌雄各15只，體質(zhì)量19～22 g，7周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004］，動物飼養(yǎng)、實驗操作均在遵義醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心進行［動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0006］。實驗動物處置嚴(yán)格遵循“3R”原則，實驗獲得遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)［KLLY（A）-2020-068］。實時熒光定量PCR儀（瑞氏Roche公司）；光學(xué)顯微鏡（日本NIKON 公司）。5%咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030129，批號：40200907）；注射用鹽酸川芎嗪（平光制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031302，批號：202007031）；PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（日本TaKaRa 公司）；逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物（北京擎科生物科技有限公司）；兔抗鼠TNF-α、IL-17、VEGF單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DAB 染色液試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 動物處理 將30只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后剔除其背部4 cm×2 cm 區(qū)域毛發(fā)，隨機分為正常組、模型組、低TMP組、中TMP組、高TMP組，每組6只。正常組涂抹凡士林62.5 mg/d，連續(xù)7 d。模型組及TMP各組涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg/d，連續(xù)7 d，涂抹3 d 后背部皮膚出現(xiàn)明顯炎癥表現(xiàn)，形成銀屑病樣皮損。第4 天開始，低、中、高TMP 組分別予腹腔注射20、40及100 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液［8］，正常組及模型組注射等量生理鹽水，連續(xù)用藥9 d。每天拍攝各組小鼠皮損照片，通過銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分對皮損嚴(yán)重程度進行評估（從紅斑、浸潤、鱗屑3個方面進行評分，分值0～4 分，0=無皮損；1=輕度；2=中度；3=重度；4=極重度）。藥物干預(yù)結(jié)束，取適量小鼠背部皮損2份，一份用于病理診斷及免疫組化檢測；一份用于qRT-PCR檢測。

1.2.2 qRT-PCR 法檢測小鼠皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF mRNA 的表達 根據(jù)試劑說明，提取各樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，配制擴增反應(yīng)體系，于實時熒光定量PCR儀上進行擴增，引物序列見表1。擴增條件：95℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，65 ℃15 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

Tab.1 The primer sequences for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 皮損組織病理學(xué)檢測 所有皮損組織用10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋并切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮損組織學(xué)改變。

1.2.4 免疫組化染色檢測皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF 的蛋白表達 所有皮損組織切片經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，TNF-α（1∶500）、IL-17（1∶500）、VEGF（1∶300）一抗孵育，二抗孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，采用Image Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，qRT-PCR 原始數(shù)據(jù)予對數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用LSD-t法（方差齊）或Tamhane's T2（方差不齊）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮損表現(xiàn) TMP 注射第1 天（涂抹咪喹莫特乳膏3 d 后），小鼠背部皮膚呈現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)（明顯紅斑、鱗屑）；隨著藥物干預(yù)時間延長，模型組小鼠皮損逐漸加重，呈現(xiàn)典型銀屑病樣皮損表現(xiàn)，而TMP 組小鼠皮損逐漸減輕。TMP 注射9 d 后，模型組小鼠背部仍可見明顯紅斑、鱗屑，TMP各組小鼠背部紅斑、鱗屑較模型組明顯減少，中、高TMP組小鼠背部紅斑減輕尤為明顯，未見明顯鱗屑，見圖1。皮損PASI 評分結(jié)果顯示：TMP 干預(yù)3、6 及9 d，與正常組比較，僅9 d 時高TMP 組與正常組的PASI 評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），3 d時，模型組與TMP各劑量組PASI 評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），6 d時，模型組與低、中及高TMP組PASI評分依次降低（P＜0.05），9 d時，中TMP 組與低、高TMP 組PASI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

Fig.1 General view of skin lesions in four groups of mice圖1 各組小鼠皮損大體觀

Fig.2 Comparison of PASI scores of skin lesions between the five groups of mice圖2 各組小鼠背部皮損PASI評分比較

2.2 各組皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF mRNA 相對表達水平比較 與正常組比較，模型組TNF-α、IL-17、VEGF mRNA相對表達水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，中、高TMP 組的TNF-α mRNA 相對表達水平降低（P＜0.05），低、中、高TMP 組的IL-17 mRNA 相對表達水平也降低（P＜0.05），高TMP 組VEGF mRNA 相對表達水平降低（P＜0.05）；與低TMP 組相比，中、高TMP 組的TNF-α、IL-17 mRNA相對表達水平降低（P＜0.05），高TMP 組VEGF mRNA相對表達水平降低（P＜0.05）；與中TMP組相比，高TMP組IL-17及VEGF mRNA相對表達水平降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of relative expression levels of TNF-α,IL-17 and VEGF mRNA in skin lesions between the five groups of mice表2 各組皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF mRNA相對表達水平比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of TNF-α,IL-17 and VEGF mRNA in skin lesions between the five groups of mice表2 各組皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF mRNA相對表達水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與低TMP 組比較，d與中TMP組比較，P＜0.05；表中數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后所得。

組別正常組模型組低TMP組中TMP組高TMP組F TNF-α-0.039 9±0.180 3 1.037 9±0.292 0a 0.852 6±0.159 9a 0.428 8±0.152 9abc 0.367 7±0.105 0abc 25.437＊＊IL-17-0.050 6±0.209 7 0.666 4±0.235 0a-0.280 4±0.074 6ab-0.547 7±0.143 4abc-0.778 9±0.158 9abcd 51.276＊＊VEGF-0.026 6±0.151 8 1.278 9±0.254 7a 1.137 3±0.165 9a 0.801 0±0.139 8a 0.327 0±0.058 7abcd 54.334＊＊

2.3 各組皮損的病理表現(xiàn)及皮損中TNF-α、IL-17、VEGF蛋白表達

2.3.1 HE 染色 模型組小鼠的皮損組織呈現(xiàn)為典型的銀屑病樣病理改變，表皮出現(xiàn)過度角化，其間可見少量角化不全，顆粒層減少，棘層肥厚，表皮突向下方伸長；而低、中及高TMP 組小鼠皮損的銀屑病樣病理改變較模型組依次減輕，見圖3。

Fig.3 HE staining results of skin lesions in five groups（×200）圖3 各組皮損HE染色結(jié)果（×200）

2.3.2 各組TNF-α、IL-17、VEGF 蛋白相對表達水平比較 與正常組比較，TNF-α、IL-17、VEGF 在模型組及低、中、高TMP 組皮損的表皮細胞胞漿內(nèi)均有表達。與模型組比較，中、高TMP 組TNF-α 相對表達水平降低（P＜0.05），低、中、高TMP 組IL-17、VEGF 相對表達水平降低（P＜0.05）；與低TMP 組比較，高TMP組TNF-α、VEGF相對表達水平降低（P＜0.05），中、高TMP 組IL-17 相對表達水平降低（P＜0.05）；與中TMP 組比較，高TMP 組VEGF 相對表達水平降低（P＜0.05），見圖4、表3。

Fig.4 Immunohistochemical results of TNF-α,IL-17 and VEGF in skin lesions of different groups(×200)圖4 各組皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF免疫組化結(jié)果（×200）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of TNF-α,IL-17 and VEGF proteins in skin lesions between the five groups of mice表3 各組皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF蛋白相對表達水平比較 （n=6，IOD，）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of TNF-α,IL-17 and VEGF proteins in skin lesions between the five groups of mice表3 各組皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF蛋白相對表達水平比較 （n=6，IOD，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與低TMP組比較，d與中TMP組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組低TMP組中TMP組高TMP組F TNF-α 0.004±0.002 0.019±0.003a 0.017±0.003a 0.014±0.001ab 0.013±0.001abc 98.959＊＊IL-17 0.002±0.001 0.022±0.001a 0.015±0.001ab 0.009±0.001abc 0.008±0.001abc 718.474＊＊VEGF 0.001±0.001 0.021±0.003a 0.019±0.001ab 0.012±0.001ab 0.008±0.001abcd 367.192＊＊

3 討論

銀屑病主要的組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮增生、血管生成增加及免疫細胞浸潤［9］。目前其具體發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)研究認為銀屑病發(fā)生、發(fā)展的核心主要是T 細胞，尤其是輔助性T 細胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［10］。當(dāng)機體免疫系統(tǒng)紊亂時，T細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞被激活，同時分泌TNF-α、IL-17、干擾素-1（interferon-1，IFN-1）等細胞因子，在多種細胞因子的共同作用下，角質(zhì)形成細胞（keratinocyte，KC）過度增殖并釋放VEGF、血管生成素等來促進真皮淺層血管新生，而KC的增殖又可促進更多炎性細胞因子的分泌，從而放大機體內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生。當(dāng)前，銀屑病的治療藥物多以西藥為主，短期療效雖佳，但無法根治。近年來，生物制劑對銀屑病的治療顯示出更好的療效，但因價格昂貴且需長期維持治療同樣限制了其臨床應(yīng)用，且安全性及長期療效亦不確定［11］。因此，進一步研究銀屑病的發(fā)病機制，尋找更加安全、有效的治療藥物仍是皮膚科學(xué)界的研究重點。相對于西藥及生物制劑的應(yīng)用限制，中藥治療銀屑病有其獨特的優(yōu)勢。

TMP系從中藥川芎中分離提純所得到的一種酰胺類的生物堿［12］。研究證實，其具有擴張血管及抑制血小板聚集［13］、抗腫瘤［14］、清除氧自由基及抑制缺血再灌注損傷［15］、抗炎［16］等多種藥理作用。長久以來，TMP臨床上多被用于治療心腦血管疾病［17-18］。盡管近年來其在肝臟［19］、肺［20］、脊髓損傷［21］等疾病中的治療作用也逐漸被報道，但在皮膚疾病中，尤其是對銀屑病的治療作用仍鮮見報道?，F(xiàn)有研究表明，TMP 可通過下調(diào)TNF-α［22］、IL-17［23］、VEGF［24］等多種細胞因子水平，從而減輕機體炎性損傷，達到治療疾病的作用。本研究通過外用咪喹莫特乳膏成功誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損，利用TMP 進行治療后發(fā)現(xiàn)，TMP 組小鼠的銀屑病樣皮損的大體表現(xiàn)及組織病理學(xué)表現(xiàn)均較模型組明顯好轉(zhuǎn)，且隨著用藥時間的延長，低、中及高TMP 組小鼠背部皮損PASI 評分亦呈逐漸降低趨勢。此外，模型組小鼠皮損內(nèi)TNF-α、IL-17 及VEGF 的mRNA 及蛋白表達水平較正常組均升高，而低、中、高TMP組的表達量較模型組呈降低趨勢，證實TMP尤其是高TMP組可顯著下調(diào)小鼠銀屑病樣皮損內(nèi)TNF-α、IL-17、VEGF 的表達水平。

綜上所述，TMP 可通過降低小鼠銀屑病樣皮損內(nèi)的TNF-α、IL-17、VEGF 的表達水平，抑制皮損的炎癥反應(yīng)，緩解其病情嚴(yán)重程度；其中，高劑量組治療效果尤為顯著。