王天光,陳澤倫,趙朝陽,王石堅(jiān),葛廣全

心力衰竭(heart failure,HF)是指各種原因引起心排血量減少,不足以提供組織代謝的一種復(fù)雜綜合征,是多數(shù)心臟疾病的共同轉(zhuǎn)歸,是導(dǎo)致病人死亡的關(guān)鍵因素[1]。相關(guān)研究顯示,HF的發(fā)生與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān),HF可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,而心肌細(xì)胞凋亡又可加速HF進(jìn)展[2-3]。因此,尋找有效的藥物抑制HF過程中心肌細(xì)胞凋亡尤為重要。益母草堿是臨床常用中藥材益母草的主要有效成分,具有抗氧化、活血化瘀、抗血小板聚集、利水消腫、保護(hù)心血管等功效[4-5]。有研究顯示,益母草堿可抑制HF大鼠心肌重構(gòu),改善心功能[6]。關(guān)于益母草堿對(duì)HF過程中心肌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制尚未明確。

核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一種作用廣泛的核轉(zhuǎn)錄因子,參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理、生理過程中相關(guān)基因的調(diào)控。多項(xiàng)研究顯示,NF-κB活化可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[7-8]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,活化的ERK可激活NF-κB,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9-10]。然而,益母草堿能否調(diào)控ERK/NF-κB信號(hào)通路尚未明確?；诖?本研究采用腹腔注射阿霉素(adriamycin,ADR)法建立HF大鼠模型,觀察益母草堿對(duì)HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響,探討ERK/NF-κB信號(hào)通路作為益母草堿藥理機(jī)制的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠,6～7周齡,體質(zhì)量210～230 g,購自北京華阜康生物公司,使其穩(wěn)定、適應(yīng)3 d后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),溫度22～25 ℃,濕度45%～55%,光照12 h/黑暗12 h交替模式,大鼠自由飲食、進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 益母草堿(貨號(hào)SND-5171,滁州仕諾達(dá)生物科技公司);ADR(貨號(hào)D8740,Solarbio公司);ERK抑制劑(PD98059)(貨號(hào)HY-12028,MedChemExpress公司);末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)檢測試劑盒、RIPA裂解液(貨號(hào)分別為C1091、P0013B,Beyotime公司);核蛋白抽提試劑盒(貨號(hào)R0050,Solarbio公司);兔抗大鼠一抗anti-NF-κB p65(貨號(hào)sc-8008,Santa Cruz公司);兔抗大鼠一抗anti-B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)、anti-Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、anti-GAPDH、anti-Histone H3、anti-ERK、anti-磷酸化ERK(p-ERK)、anti-NF-κB抑制蛋白(IκB)α、anti-磷酸化IκBα(p-IκBα)及山羊抗兔二抗(貨號(hào)分別為ab196495、ab32503、ab181602、ab1791、ab184699、ab201015、ab32518、ab133462、ab6721,Abcam公司)。

動(dòng)物彩色多普勒超聲儀(動(dòng)物彩超機(jī))(型號(hào)MyLabTMSigma VET,上海玉研科學(xué)儀器公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào)Olympus CX43,上海通灝光電科技公司);石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)(型號(hào)分別為HS-B7126-B、HS-S7220-B,沈陽恒松科技公司);凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)Invitrogen?E-Gel Imager,廣州市科之藍(lán)儀器公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立HF模型 參照相關(guān)文獻(xiàn)[11],采用腹腔注射ADR法建立HF模型。腹腔注射ADR(0.8 mg/mL),總劑量15 mg/kg,前3周3 mg/kg,后3周2 mg/kg,每周1次。Control組腹腔注射等體積的生理鹽水。6周后采用動(dòng)物彩超機(jī)測定大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),LVEF<45%即為HF模型建立成功。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥干預(yù) 隨機(jī)將HF模型大鼠分為HF組、低劑量益母草堿(L-益母草堿)組[益母草堿劑量為7.5 mg/(kg·d),灌胃給藥]、高劑量益母草堿(H-益母草堿)組[益母草堿劑量為30 mg/(kg·d),灌胃給藥]及ERK抑制劑組[PD98059 10 mg/(kg·d),腹腔注射][6],每組8只;另取正常SD大鼠8只作為Control組。根據(jù)分組進(jìn)行給藥干預(yù),每日1次,連續(xù)14 d,Control組、HF組灌胃等體積的生理鹽水。

1.3.3 動(dòng)物彩超機(jī)測定心功能指標(biāo) 末次給藥24 h后,腹腔注射2%的戊巴比妥鈉使大鼠輕度麻醉,對(duì)胸部進(jìn)行消毒、備皮,連接動(dòng)物彩超機(jī),測定LVEF、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(LVFS)變化。

心功能指標(biāo)檢測結(jié)束后處死大鼠,取出心臟,清洗后切取部分心肌組織,將其置于4%多聚甲醛中固定20 h,經(jīng)脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋,制作成4 μm厚的切片用于TUNEL染色、免疫組化實(shí)驗(yàn)。剩余心肌組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 取制備好的切片,經(jīng)常規(guī)脫蠟至水處理后,依次浸于蛋白酶K溶液、3%過氧化氫(H2O2)溶液中,之后依次孵育TUNEL反應(yīng)液(37 ℃,60 min)、反應(yīng)終止液(室溫20 min),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Streptavidin(室溫30 min),最后滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況,并計(jì)算凋亡率。

1.3.5 免疫組化法測定心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取制備好的切片,經(jīng)常規(guī)脫蠟至水處理后進(jìn)行抗原修復(fù),之后經(jīng)3%H2O2溶液、血清封閉液中浸泡處理,依次孵育一抗anti-Bcl-2、anti-Bax(4 ℃過夜)、二抗(37 ℃,30 min)、DAB顯色液(室溫5 min),之后經(jīng)蘇木精浸染、透明、脫水、封片,光學(xué)顯微鏡下觀察Bcl-2、Bax表達(dá)情況并拍照,使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織ERK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取保存的心肌組織,解凍后分別提取總蛋白(RIPA裂解液)與核蛋白(核蛋白抽提試劑盒),采用二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒測定蛋白濃度、Lodding Buffer進(jìn)行定量,通過凝膠電泳分離蛋白,之后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h后孵育一抗anti-GAPDH、anti-Histone H3、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-IκBα、anti-NF-κB p65(4 ℃過夜),次日孵育二抗(室溫2 h),加入顯色劑后置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照,使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組心功能指標(biāo)變化 與Control組比較,HF組LVEF、LVFS均減少,LVESD、LVEDD均增加(P<0.05);與HF組比較,L-益母草堿組、H-益母草堿組、ERK抑制劑組LVEF、LVFS均增加,LVESD、LVEDD均減少(P<0.05)。與L-益母草堿組比較,H-益母草堿組、ERK抑制劑組LVEF、LVFS均增加,LVESD、LVEDD均減少(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組心功能指標(biāo)變化(±s)

2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡情況 與Control組比較,HF組心肌細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05);與HF組比較,L-益母草堿組、H-益母草堿組、ERK抑制劑組心肌細(xì)胞凋亡率減少(P<0.05);與L-益母草堿組比較,H-益母草堿組、ERK抑制劑組心肌細(xì)胞凋亡率減少(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組心肌組織TUNEL染色圖(×400)

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位:%

2.3 各組心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與Control組比較,HF組心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)減少,Bax蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與HF組比較,L-益母草堿組、H-益母草堿組、ERK抑制劑組心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)增加,Bax蛋白表達(dá)減少(P<0.05);與H-益母草堿組比較,H-益母草堿組、ERK抑制劑組心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)增加,Bax蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 各組心肌組織凋亡相關(guān)蛋白免疫組化圖(×200)

表3 各組心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s)

2.4 各組心肌組織ERK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與Control組比較,HF組心肌組織p-ERK、p-IκBα、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)均增加(P<0.05);與HF組比較,H-益母草堿組、ERK抑制劑組心肌組織p-ERK、p-IκBα、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)均減少(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組心肌組織ERK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白條帶圖

表4 各組心肌組織ERK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

HF發(fā)病機(jī)制多且復(fù)雜,其中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用,貫穿HF整個(gè)過程,導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)行性丟失,久之使心肌收縮功能障礙,發(fā)展為HF[12]。調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的眾多因子中Bax、Bcl-2為經(jīng)典因子,其中Bax是一種促凋亡蛋白,以Bax-Bax同源二聚體的形式插入至線粒體外膜中,形成微孔結(jié)構(gòu),從而使線粒體內(nèi)的凋亡因子外溢,引發(fā)細(xì)胞凋亡;Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,可競爭性地與Bax結(jié)合,抑制Bax-Bax同源二聚體微孔結(jié)構(gòu)形成,從而抑制細(xì)胞凋亡[13-14]。

益母草堿是從中藥材益母草中分離、提取的一種生物堿,為益母草的有效成分,最初作為一種婦科常用藥而被熟知,隨著對(duì)其的深入研究,發(fā)現(xiàn)益母草堿具有顯著的保護(hù)心血管作用[15-16]。有研究將益母草堿應(yīng)用于HF大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HF大鼠心肌重構(gòu)、心功能均得到了明顯改善[6]。目前關(guān)于益母草堿對(duì)HF過程中心肌細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)作用機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示,與Control組比較,HF組LVEF、LVFS及心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)均減少,LVESD、LVEDD、心肌細(xì)胞凋亡率及心肌組織Bax蛋白表達(dá)均增加,表明HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著,且心功能變差;經(jīng)L-益母草堿、H-益母草堿干預(yù)后,上述情況均改善,且H-益母草堿效果更佳,表明益母草堿可抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能,且高劑量效果更佳,故選取H-益母草堿探討藥理機(jī)制。

NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,與心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生關(guān)系密切,正常情況下,NF-κB以二聚體的形式與IκBα結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí),IκBα發(fā)生磷酸化使NF-κB解離、活化并移位至細(xì)胞核內(nèi),從而調(diào)控Bax、Bcl-2等相關(guān)凋亡基因表達(dá),誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[17-18]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一員,多項(xiàng)研究顯示,ERK通過磷酸化活化之后可激活NF-κB[19-20]。本研究結(jié)果顯示,與Control組比較,HF組心肌組織p-ERK、p-IκBα、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白水平均增加,表明ERK/NF-κB信號(hào)通路激活參與HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生;經(jīng)H-益母草堿干預(yù)后,HF大鼠心肌組織p-ERK、p-IκBα、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白水平均降低,表明益母草堿可抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路激活。然而,益母草堿能否通過抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路激活,抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡尚未明確。由于無合適的ERK激活劑,本研究設(shè)置ERK抑制劑干預(yù)為平行對(duì)照組,結(jié)果顯示,抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路激活后,HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低,心功能明顯改善,效果與高劑量益母草堿相當(dāng)。結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果,推測抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路激活可能為益母草堿的藥理機(jī)制。

綜上所述,益母草堿可抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能,可能通過抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路激活而實(shí)現(xiàn),本研究結(jié)果可為治療HF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。