孟 鵬，吳忠玉

（1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥物研究所，山東 濟(jì)南 250117；2. 濟(jì)南良福精合醫(yī)藥科技有限公司，山東 濟(jì)南 250117）

尿石素（urolithin）是天然多酚類化合物，是食物中的鞣花單寧被腸道菌群代謝產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物[1]。研究表明，尿石素具有抗氧化、抗炎、抗癌、誘導(dǎo)線粒體自噬等多種生物活性[2-5]。尿石素A（urolithin-A，UA）、尿石素B（urolithin-B，UB）、尿石素C（urolithin-C，UC）是目前研究最廣泛的尿石素的異構(gòu)體。

傳統(tǒng)的食品和藥品毒性測(cè)定方法，如cell counting kit-8（CCK-8）、噻唑藍(lán)法（MTT）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）等，可在多細(xì)胞水平上評(píng)估藥物的毒性，卻無法在亞細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)藥物毒性的準(zhǔn)確評(píng)估和分析[6-9]。CCK-8試劑中的主要成分是2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（WST-8），它被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶氧化為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物。CCK-8的細(xì)胞毒性檢測(cè)中生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此CCK-8可在多細(xì)胞水平進(jìn)行毒性檢測(cè)。以熒光顯微成像技術(shù)為原理的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（structure illumination microscopy，SIM），利用結(jié)構(gòu)光突破衍射極限，然后通過結(jié)構(gòu)光的旋轉(zhuǎn)移動(dòng)和算法識(shí)別，實(shí)現(xiàn)了線粒體的超分辨成像[10]。此外，SIM還具有光毒性低、成像速度快、熒光探針要求低和樣品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。細(xì)胞遇到有毒物質(zhì)時(shí)，線粒體中球狀線粒體的比例增加，可以此作為判斷藥物毒性大小的依據(jù)[13]。因此可利用SIM對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的超分辨成像，評(píng)估尿石素亞細(xì)胞水平的毒性差異（見圖1）。

圖1 CCK-8和SIM毒性檢測(cè)原理對(duì)比

本文通過SIM于亞細(xì)胞水平研究3種尿石素亞型UA、UB和UC對(duì)HeLa細(xì)胞中線粒體的影響，并采用線粒體長(zhǎng)寬比的數(shù)據(jù)分析方法探究3種亞型在亞細(xì)胞水平的毒性，建立藥物毒性亞細(xì)胞水平毒性研究方法；并將SIM毒性檢測(cè)方法與經(jīng)典的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法CCK-8對(duì)比，評(píng)價(jià)UA、UB和UC在多細(xì)胞層面和亞細(xì)胞層面的細(xì)胞毒性差異。

1 材料與儀器

1.1 儀器

數(shù)顯三用恒溫水箱（山東歐萊博）；TDZ5-WS醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀）；QP-160二氧化碳培養(yǎng)箱（濟(jì)南鑫貝西）；BSC-1500IIA2-X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西）；XD-202倒置生物顯微鏡（南京江南永新光學(xué)）；F-320熒光分光光度計(jì)（天津港東科技）；LDZF-50L-II立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安）；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；SIM顯微鏡（Delta Vision，USA）。

1.2 藥品與試劑

尿石素A（1143-70-0），尿石素B（1139-83-9），尿石素C（165393-06-6）（麥克林）；胎牛血清和MTG（Mito-Tracker Green）（賽默飛）；CCK-8（Med Chem Express）；PBS和DMEM（Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium）（上海達(dá)特希爾和）；Penicillin-streptomycin（10000 U/ml，Gibco）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞取自劉飛實(shí)驗(yàn)室（山東省藥學(xué)科學(xué)院）。HeLa細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基（添加10 % FBS、1 %青霉素和鏈霉素）中培養(yǎng)，并置入37 ℃，5 %二氧化碳培養(yǎng)箱。

2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

用培養(yǎng)基稀釋的HeLa細(xì)胞以8×103個(gè)/孔的密度接種至96孔板，并于37 ℃含5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后使用含0，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μmol/L尿石素的DMEM溶液代替96孔板中的原始培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育2 h。最后，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定450 nm處的吸光度。

2.3 藥物孵育

將UA、UB、UC用無色DMEM分別配制為最終濃度為10 μmol/L和40 μmol/L溶液，置于37 ℃水浴預(yù)熱10 min。然后分別將細(xì)胞與各個(gè)濃度細(xì)胞亞型的溶液孵育12 h，用預(yù)熱的DMEM洗滌7次，然后進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記。

2.4 活細(xì)胞標(biāo)記

線粒體的標(biāo)記采用線粒體商業(yè)探針MTG。具體操作：將MTG用無色DMEM配制為最終濃度為100 nmol/L溶液，置于37 ℃的水浴鍋中預(yù)熱10 min。然后，將細(xì)胞與100 nmol/L MTG孵育30 min后，用預(yù)熱的DMEM洗滌7次，最后更換預(yù)熱的無色DMEM用于超分辨顯微鏡成像。

2.5 SIM顯微鏡成像

HeLa細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于35 mm玻璃底培養(yǎng)皿，并與2 ml 含10 % FBS的DMEM一起孵育24 h（5 % CO2，37 ℃）。經(jīng)過藥物孵育12 h和活細(xì)胞標(biāo)記后在配備100×/1.42數(shù)值孔徑油浸物鏡和固態(tài)激光器下成像。MTG在488 nm處激發(fā)并于500～550 nm處發(fā)射。

2.6 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8和Image J進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；在正態(tài)分布情況下，結(jié)果統(tǒng)計(jì)比較用t檢驗(yàn)；在非正態(tài)分布情況下，結(jié)果統(tǒng)計(jì)比較用Mean-Whitney檢驗(yàn)。顯著性水平設(shè)置為P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（±s）。線粒體的長(zhǎng)寬比分析中，按照線粒體長(zhǎng)寬比的大小將棒狀和顆粒狀的線粒體分成1≤長(zhǎng)/寬＜1.5（圓狀線粒體），1.5≤長(zhǎng)/寬＜2（中間狀線粒體），2≤長(zhǎng)/寬＜5（管狀線粒體），5≤長(zhǎng)/寬（纖維狀線粒體）4類進(jìn)行分析（見圖2）。

圖2 線粒體長(zhǎng)寬比分析

3 結(jié)果

3.1 CCK-8對(duì)尿石素3種亞型的細(xì)胞毒性分析

使用CCK-8分別檢測(cè)UA、UB、UC（1～40.0 μmol/L）孵育HeLa細(xì)胞12 h后的細(xì)胞毒性（見圖3）。藥物濃度為10.0 μmol/L時(shí)，和對(duì)照組相比3組均無明顯的細(xì)胞毒性。表明3種藥物的毒性微弱，CCK-8無法檢測(cè)出尿石素3種亞型10.0 μmol/L濃度以下的毒性。藥物濃度為20 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，只有UC能檢測(cè)到明顯的藥物毒性，表明UC毒性最強(qiáng)。藥物濃度為40.0 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，3種藥物均表現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性。

圖3 3種尿石素亞型的細(xì)胞毒性檢測(cè)

3.2 SIM顯微鏡對(duì)尿石素3種亞型的分析

3.2.1 線粒體的SIM成像 為了避免藥物自發(fā)熒光對(duì)SIM成像的影響，使用熒光分光光度計(jì)分析3種藥物10.0 μmol/L時(shí)的熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明，488 nm波長(zhǎng)激發(fā)下無顯著的熒光（見圖4），因此選用商業(yè)線粒體探針MTG，用于活細(xì)胞線粒體成像（MTG在488 nm下發(fā)綠色熒光）。

圖4 3種尿石素亞型激發(fā)光下的熒光光譜（488 nm）

將未經(jīng)藥物處理的HeLa細(xì)胞用MTG進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記后，用SIM進(jìn)行成像（見圖5）。由圖5可見，在超高分辨率SIM顯微鏡下，可清晰地觀測(cè)到未進(jìn)行藥物處理的細(xì)胞中的絲狀的棒狀線粒體，并能看到線粒體的單個(gè)形態(tài)和線粒體嵴的構(gòu)造。使用圖像處理軟件Image J分析未經(jīng)藥物處理的HeLa細(xì)胞線粒體的長(zhǎng)/寬數(shù)據(jù)，正常的HeLa細(xì)胞中管狀的線粒體占比最大，纖維狀的線粒體占比最小。

圖6 濃度10.0 μmol/L和40.0 μmol/L的3種尿石素亞型的線粒體SIM成像和長(zhǎng)寬比分析

3.2.2 藥物處理的細(xì)胞線粒體的形態(tài)分析 根據(jù)3.1項(xiàng)結(jié)果，藥物濃度10.0 μmol/L是3種亞型均檢測(cè)不到細(xì)胞毒的最大濃度，40.0 μmol/L是3種亞型均能檢測(cè)到顯著細(xì)胞毒的最小濃度。因此將10.0 μmol/L和40.0 μmol/L作為SIM成像的濃度，與SIM毒性檢測(cè)對(duì)比。分別使用濃度為10.0 μmol/L和40.0 μmol/L的UA、UB、UC孵育HeLa細(xì)胞12 h，MTG標(biāo)記活細(xì)胞之后，使用SIM成像并統(tǒng)計(jì)分析線粒體長(zhǎng)寬比（見圖5）。

由圖5可見，藥物濃度為10.0 μmol/L時(shí)，3個(gè)加藥組均球狀線粒體增加和管狀的線粒體減少，與對(duì)照組相比呈顯著性，表明線粒體形態(tài)損傷，檢測(cè)到3種尿石素亞型的毒性。藥物濃度為40.0 μmol/L時(shí)，3個(gè)加藥組也球狀線粒體增加和管狀的線粒體減少，與對(duì)照組相比呈顯著性；UC組的球狀線粒體比例最大，管狀線粒體比例最小，這表明相同濃度的3種藥物亞型中UC在亞細(xì)胞水平毒性最強(qiáng)，與CCK-8的結(jié)果一致。結(jié)果表明，SIM在亞細(xì)胞水平的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法能在更低的藥物濃度檢測(cè)到藥物毒性，這對(duì)尿石素在食品藥品領(lǐng)域的應(yīng)用和作用機(jī)制研究具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

通過CCK-8多細(xì)胞水平和SIM亞細(xì)胞水平的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，評(píng)估了尿石素3種亞型的細(xì)胞毒性。3種尿石素亞型對(duì)HeLa細(xì)胞均有輕微的細(xì)胞毒性影響，且UC的細(xì)胞毒性在3種亞型中最強(qiáng)，為后續(xù)的尿石素的相關(guān)研究提供了參考。CCK-8和SIM超分辨成像方法對(duì)比表明，SIM亞細(xì)胞水平的細(xì)胞毒性檢測(cè)能在更低的藥物濃度時(shí)檢測(cè)到毒性。SIM為食品和藥品亞細(xì)胞水平的毒性評(píng)估提供了新方法。

本文基于超分辨成像技術(shù)，開發(fā)了新的藥物評(píng)估方法，用于精準(zhǔn)分析藥物亞型的活性差異和潛在細(xì)胞毒性。與傳統(tǒng)細(xì)胞毒性測(cè)定方法相比，超分辨成像方法可在亞細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)藥物精準(zhǔn)評(píng)估。該方法可用于食品與藥品亞細(xì)胞水平的毒性檢測(cè)。