李思軍，譚志鵬，吳文信，黎 萍，鐘 杰，肖艷松

（1.湖南省煙草公司郴州市公司桂陽縣公司，湖南 郴州 424400；2.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙 410128）

煙草（Nicotiana tabacumL.）是我國重要的經(jīng)濟作物，也是一種藥用植物。近年來，由于氣候環(huán)境的變化，加之種植品種單一、煙田連作比例高等因素，煙草病害也愈發(fā)嚴重，且種類多樣，除了常規(guī)的青枯病、黑脛病、病毒病等普遍發(fā)生以外，其他非主要病害也零星發(fā)生。由于診斷困難加大了防治難度，延誤了最佳防治時期，因此這些非主要病害極易發(fā)展為主要病害。例如：2019 年在湖南發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病零星發(fā)生[1]，而此后該病害在湖南各煙區(qū)流行發(fā)病，給煙農(nóng)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。因此，及時了解煙草發(fā)病情況，明確病因及其流行規(guī)律是保障煙葉安全生產(chǎn)的重要舉措。

2020—2022 年，在湖南省各煙區(qū)進行病害調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)了一些葉部病害導致煙草嚴重減產(chǎn)和品質(zhì)下降，其中在湖南省郴州市桂陽縣煙區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種發(fā)生較普遍的葉部病害，由于田間現(xiàn)場鑒定困難，因此病因不明確，未能有效識別和防控，造成了較大的損失?；诖?，筆者對該葉部病害進行了病原菌的分離與鑒定，旨在為病害的診斷識別以及科學防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離與純化

2020 至2021 年，在湖南省郴州市桂陽縣煙區(qū)發(fā)病嚴重地塊采集煙葉病樣，將呈現(xiàn)水漬狀、具輪紋或壞死病斑的葉片樣本收集后，裝入干凈的塑封袋，帶回實驗室通過組織分離法進行病原菌的分離鑒定[2]。剪取病健交界處約1 cm2大小葉片組織，先用70 %的乙醇處理30 s，再用2%次氯酸鈉處理1 min，用無菌水中漂洗3 次后用無菌濾紙吸干水分并移入含有鏈霉素的PDA 平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d。從長出的菌落邊緣打取菌餅轉(zhuǎn)接至新的PDA 平板上，通過單孢分離進行純化，純化后菌種用40 %的甘油于-80℃冰箱保存。

1.2 病原菌菌落及孢子形態(tài)觀察

選取代表性分離純化的菌株Es-5 接種到PDA平板上于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行黑暗培養(yǎng)，7 d 左右待菌落長滿平板后，觀察菌落的形態(tài)特征，在光學顯微鏡下觀察并記錄菌絲和孢子形態(tài)特征，對病原菌進行形態(tài)學鑒定。

1.3 病原菌rDNA-ITS 序列擴增及分析

提取菌株Es-5 的基因組DNA，以引物ITS4/ITS5擴增病原菌的rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) （rDNA-ITS）基因。此外，利用引物對ACT-512F/ACT-783R 和TUB2-T1/Bt2b 分別擴增Es-5 肌動蛋白（ACT）和微管蛋白（TUB）基因的部分區(qū)域。所用引物如表1 所示[3]。擴增反應體系（25 μL）：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL、上下游引物各1 μL（10 mmol/L）、ddH2O 9.5 μL。反應條件為：95℃，3 min；95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，45 s，35 個循環(huán)；72℃延伸5 min。將PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標DNA 片段，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列用BLASTn 在GenBank 進行同源性比對，并上傳到GenBank 獲得登錄號。采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）在MEGA 6 軟件進行多基因聯(lián)合系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，以自舉法（bootstrap）進行1 000 次重復檢驗[4]。

表1 分子鑒定所用引物

1.4 病原菌的致病性測定

通過孢子液進行盆栽煙草活體接種測定菌株Es-5的致病性。將Es-5菌株接種到PD液體培養(yǎng)基中，在28℃下以180 r/min 的速度振蕩培養(yǎng)5 d 后，用滅菌紗布過濾收集孢子液，將孢子濃度調(diào)整到1×106個/mL。將生長健康、長勢相近的2 月齡盆栽云煙87 煙草葉片用70%酒精擦拭消毒后，噴灑菌株孢子液，處理3 盆煙草，每盆煙草接種2 片葉，對照組噴灑無菌水。將接種后的煙草盆栽置于提前用酒精擦拭消毒的接種盒中，保濕培養(yǎng)2 d 后，置于溫室中培養(yǎng)（25℃，90%相對濕度，L ∶D=12 h ∶12 h），觀察并記錄發(fā)病情況。從發(fā)病葉片組織處再次進行病原菌分離和鑒定，以完成科赫氏法則。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學鑒定

由圖1 可知，菌株Es-5 在PDA 平板上氣生菌絲發(fā)達，初為灰白色，后分泌色素，中心為黃褐色至深褐色，邊緣白色，整齊，略微往外凸起；其分生孢子為單孢，呈梭形或卵圓形，大小為（3.2～8.3）×（1.8～4.0）μm（n=50）；厚垣孢子為暗色，單細胞或多細胞連在一起、球形或近球形，大小為（8.5～17.5）×（6.0～15.0）μm（n=50）。

圖1 菌株Es-5 在PDA 平板上的菌落與孢子形態(tài)

2.2 分離菌株的分子鑒定

以菌株Es-5 的基因組DNA 為模板，用通用引物ITS4 和ITS5 進行PCR 擴增，擴增獲得約503 bp大小的片段（登錄號：OP604274）（圖2）。序列測定后用BLASTn 在NCBI/GenBank 中進行同源性比較，結(jié)果表明，菌株Es-5 的rDNA-ITS序列與高粱附球菌Epicoccum sorghinum（MT123053.1）具有99.8%的相似性。為了進一步明確菌株的分類地位，擴增了菌株Es-5 的ACT和TUB基因部分區(qū)域。測序結(jié)果表明，Es-5 的ACT和TUB基因片段擴增產(chǎn)物大小分別為240 和522 bp （圖2）。同源性比對顯示ACT和TUB序列分別與E.sorghinum的相應基因具有100%和99.81%的相似性。

圖2 菌株Es-5 的ITS、ACT 和TUB 基因的PCR 擴增

利用鄰接法構(gòu)建了基于ITS、ACT和TUB的多基因聯(lián)合樹，結(jié)果如圖3 所示，Es-5 聚類于高粱附球菌E.sorghinum所在的分支。因此，結(jié)合形態(tài)學和分子生物學分析結(jié)果可確定Es-5 菌株為E.sorghinum。

圖3 菌株Es-5 的ITS、ACT 和TUB 多基因系統(tǒng)進化樹

2.3 病原菌的致病性測定

將菌株Es-5 的孢子液進行盆栽煙草活體接種。結(jié)果如圖4 所示，接種Es-5 的煙草葉片上產(chǎn)生了明顯的壞死病斑，在侵染初期，病部呈水浸狀，后顏色加深，造成穿孔，有明顯黃色暈圈，與田間發(fā)病葉片癥狀類似。清水對照接種煙葉未見侵染癥狀（圖4B）。從葉片上再次進行病原菌分離鑒定，能從Es-5接種的葉片上得到相同的菌株，由此確定Es-5 為煙草葉斑病的病原。

圖4 煙草田間受害葉片病斑及人工接種致病力測定

3 結(jié)論與討論

該研究通過病原真菌分離純化、形態(tài)學觀察、基于ITS、ACT和TUB基因的系統(tǒng)進化分析，確定了從郴州發(fā)現(xiàn)的煙草葉斑病病原菌為高粱附球菌Epicoccum sorghinum。該病害侵染煙草葉片后，病斑形狀為橢圓形或不規(guī)則形，呈淡褐色或深褐色，病斑周圍有明顯的黃色暈圈。據(jù)查這是湖南省首次發(fā)現(xiàn)由E.sorghinum引起的煙草葉斑病。

E.sorghinum曾被命名為Phoma sorghina，最初是從波多黎各的高粱（Sorghum vulgare）上分離獲得[5]。除了煙草外，該病原菌在茶樹、百合、白及、七葉一枝花、卷心菜、馬唐、紅花酢漿草等多個植物上被報道引起葉斑病[5-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)E.sorghinum可引起煙草葉斑病[12]，然而目前除了廣西以外，還沒有在我國其他地區(qū)引起煙草病害的報道。

Epicoccum latusicollum是2017 年發(fā)表的新種，被認為屬于內(nèi)生菌、腐生菌或半寄生菌。Guo 等[13]報道了貴州由附球菌屬引起的煙草葉斑病，通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將其病原菌鑒定為E.latusicollum；同年云南報道了由E.latusicollum引起的煙草根腐病[14]，且E.latusicollum引起的葉斑病與該研究中E.sorghinum引起的葉斑病癥狀相似。因此，該研究結(jié)果為煙草葉斑病的診斷提供了重要參考。

近年來，烤煙種植中各種葉部病害頻繁發(fā)生，且發(fā)生概率呈逐年上升趨勢，對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了重要威脅。該研究對湖南煙區(qū)煙草上出現(xiàn)的一種新的葉斑病進行了鑒定，鑒定結(jié)果將為該病害進一步的檢測、診斷、預測以及流行規(guī)律與防治技術(shù)研究提供基礎(chǔ)。