王 瓊, 張 成, 王鑫宇, 張 倩, 劉 洋, 柳云恩

1.沈陽醫(yī)學(xué)院樹人國際學(xué)院,遼寧 沈陽 110034;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科,遼寧 沈陽 110016

結(jié)直腸癌是全球最常見的癌癥之一,也是致癌死亡的主要原因[1]。近年來,結(jié)直腸癌發(fā)病率明顯增加,約占所有癌癥的10%,是癌癥死亡的第二大常見原因,嚴重危害身體健康[2-3]。盡管早期篩查方法和治療方案的研究發(fā)展有助于顯著改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后,但結(jié)直腸癌仍然存在較大的健康隱患[4]。雖然,輔助化療取得了一定效果,但腫瘤的異質(zhì)性和疾病的危險因素使得結(jié)直腸癌患者的臨床轉(zhuǎn)歸和治療反應(yīng)差異很大[5]。因此,通過腫瘤生物學(xué)的多樣性,篩選更有意義的診斷標志物用于患者風(fēng)險分層和早期發(fā)現(xiàn),可能會延長結(jié)直腸癌患者的總生存期。核糖體蛋白L4(ribosomal protein L4,RPL4)屬于核糖體家族,該基因編碼核糖體蛋白,是60S亞基的組成部分。有研究報道,核糖體的缺乏伴隨著p53通路的激活[6]。RPL4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),RPL4的表達上調(diào)與腫瘤患者的預(yù)后呈負相關(guān),可促進腫瘤細胞的增殖和分化。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn),過氧化物還原蛋白PRDX2可以結(jié)合RPL4,從而阻礙RPL4-MDM2結(jié)合,并導(dǎo)致p53降解,促進結(jié)直腸癌細胞增殖。但目前關(guān)于RPL4在結(jié)直腸癌中功能方面的研究報道較少見,RPL4可能是一個具有前景的治療靶點,可為結(jié)直腸癌患者提供個體化治療,并為臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。本研究旨在探討RPL4在結(jié)直腸癌患者中的預(yù)后價值及生物學(xué)意義。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及處理 從癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA GDC,https：//portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載結(jié)直腸癌及正常結(jié)直腸組織的mRNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息[8],其中,具有完整信息的有524例結(jié)直腸癌患者的mRNA測序,42例患者可進行配對差異分析,417例患者具有完整的總生存期和生存狀態(tài),將上述患者的臨床數(shù)據(jù)納入研究。此外,對mRNA-seq數(shù)據(jù)的mRNA表達量用log2(UMI+1)進行標準化,并通過其平均值反映映射到多個探針的基因。在本研究中,數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制,排除存活時間≤30 d、信息不明確患者的結(jié)直腸癌樣本。

1.2 RPL4表達情況及生存分析 將TCGA中結(jié)直腸癌患者按RPL4 mRNA表達排序,根據(jù)其中位值,將結(jié)直腸癌患者分為RPL4高表達組和RPL4低表達組。采用“survival”(3.2-13版本)和“survminer”R包進行Kaplan-Meier生存分析,構(gòu)建RPL4高表達組和低表達組組間的Kaplan-Meier生存曲線,評估RPL4是否為總生存期的預(yù)后因素。

1.3 RPL4的單細胞數(shù)據(jù)分析 在腫瘤免疫單細胞中心(http：//tisch.comp-genomics.org/documentation/,TISCH)進行相關(guān)的單細胞分析[9]。分析參數(shù)如下：RPL4(基因)、主要譜系(細胞類型注釋)和結(jié)直腸癌(癌癥類型)。通過TISCH內(nèi)部處理后可視化每種細胞類型中RPL4的表達水平。

1.4 GSEA富集分析 采用GSEA軟件,利用從分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB,https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)下載的京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)集和Hallmark基因集對RPL4高表達和低表達組進行通路富集分析,探討RPL4在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能[10]。將錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.25及歸一化富集分數(shù)的絕對值>2.0定義為截止標準。

1.5 藥物敏感性分析 通過國家癌癥研究所研究中心建立的Cell Miner數(shù)據(jù)庫下載經(jīng)過處理后的RNA表達數(shù)據(jù)(RNA：RNA-seq)和藥物數(shù)據(jù)(Compound activity：DTP NCI-60)[11],選取經(jīng)過546種臨床試驗和314種美國食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)批準的藥物結(jié)果。采用最近鄰平均impute.knn函數(shù)補齊藥物缺失數(shù)據(jù),采用limma包計算RPL4高表達組和低表達組間的藥物敏感性。

1.6 免疫組織化學(xué)法 通過在線數(shù)據(jù)庫人類蛋白質(zhì)圖譜Human Protein Atlas(HPA,https：//www.proteinatlas.org/)分析RPL4基因在結(jié)直腸腫瘤組織和正常組織中蛋白水平的表達情況[12]。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科收集20例結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁標本。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測RPL4的mRNA表達水平,按照新一代RNA提取試劑NucleoZOL(MNG,德國,貨號：740404.200)說明書步驟提取結(jié)直腸組織的總RNA,使用紫外分光光度儀檢測mRNA含量。隨后采用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒,制備20 μl體系cDNA,最終采用天根熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒對cDNA進行PCR反應(yīng)。引物序列設(shè)計如下,RPL4-Forward：AGATGAATTGTACGGCACTTGG,RPL4-Reverse：GACTCTGCGATGGATCTTCTTG;GAPDH-Forward：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG。GAPDH-Reverse：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性：95℃、30 s;變性：95℃、10 s,60℃、30 s ,40個循環(huán);退火/延伸：60℃、30 s。記錄CT值,按照2-△△CT法計算RPL4在正常結(jié)直腸組織和結(jié)直腸癌組織中表達的相對水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 在線數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均在R軟件(版本4.1.1)(https：//www.r-project.org/)和Perl軟件(版本10.0.22000.675)中進行。定量PCR檢測采用GraphPad Prism v8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組內(nèi)比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPL4在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)與較差預(yù)后相關(guān) 結(jié)直腸癌組織樣本中RPL4的表達水平明顯高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖1a)。將42例配對患者進行差異分析,結(jié)直腸癌組織樣本中RPL4的表達水平大多高于正常組織(圖1b)。生存分析結(jié)果顯示,將納入的417例具有完整信息的結(jié)直腸癌患者根據(jù)中位值將其分為RPL4高表達組和低表達組,低表達組的總生存期明顯長于高表達組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)[a.結(jié)直腸癌組織中RPL4的表達高于正常組織;b.在每個患者的腫瘤組織中,RPL4的表達水平普遍高于正常組織;y軸為樣本RPL4表達的log2(TPM)值] 圖2 RPL4的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果

2.2 RPL4在結(jié)直腸癌中單細胞分析 使用TISCH數(shù)據(jù)庫在GSE166555數(shù)據(jù)集中分析RPL4在CRC中的13種細胞類型(包括免疫細胞、基質(zhì)細胞、惡性細胞等)的表達水平(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPL4主要表達于惡性細胞和免疫細胞。RPL4在原發(fā)性結(jié)直腸癌患者的腫瘤微環(huán)境中廣泛表達于T細胞、B細胞、DC細胞等免疫細胞類型,但在上皮細胞表達較低。

2.3 RPL4在結(jié)直腸癌的GSEA富集分析 經(jīng)GSEA分析發(fā)現(xiàn),在RPL4高表達組的結(jié)直腸癌患者中,在Hallmark基因集中主要在MYC和氧化磷酸化通路顯著富集(圖4a),在KEGG基因集中主要在DNA復(fù)制和細胞周期通路顯著富集,這些通路與腫瘤的生長、增殖密切相關(guān)(圖4b)。結(jié)果表明,RPL4可能在腫瘤進展中起一定作用。

2.4 結(jié)直腸癌中RPL4與藥物敏感性的相關(guān)性研究 對RPL4高、低表達組進行差異分析,比較組間的藥物的半數(shù)最大抑制濃度(IC50),結(jié)果顯示,用于治療腫瘤的貝利司他、帕博西尼和小分子XR-11576等8種藥物的IC50值在RPL4高表達組中顯著降低(P<0.05,圖5)。結(jié)果表明,結(jié)直腸癌中RPL4高表達預(yù)示著貝利司他和帕博西尼等藥物的治療效果較好。

2.5 RPL4在結(jié)直腸癌組織的表達情況 通過HPA數(shù)據(jù)庫提供的結(jié)直腸癌組織和正常組織中RPL4蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn),與正常結(jié)直腸組織比較,結(jié)直腸癌組織中RPL4的蛋白表達水平上調(diào),并且主要位于基質(zhì)細胞(圖6)。為了驗證RPL4的mRNA表達水平情況,進行qRT-RCR實驗,在結(jié)直腸癌組織中,RPL4的mRNA表達水平明顯高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖3 GSE166555中RPL4在13種主要細胞類型中的的表達水平

圖4 GSEA分析(a.高RPL4表達組和低RPL4表達組在Hallmark基因集中GSEA分析顯示的RPL4表達相關(guān)的顯著上調(diào)通路;b.高RPL4表達組和低RPL4表達組在KEGG基因集中GSEA分析顯示的RPL4表達相關(guān)的顯著上調(diào)通路)

圖5 RPL4高、低表達組抗腫瘤藥物半數(shù)最大抑制濃度比較[a.硝酸益康唑(Econazole nitrate);b.貝利司他(Belinostat);c.CUDC-305;d.雙氫青蒿素(Artenimol);e.帕博西尼(Palbociclib);f.青蒿素酯(Artesunate);g.XR-11576;h.人參皂苷(RH1)]

圖6 RPL4的免疫組化染色結(jié)果(a.正常結(jié)直腸組織;b.結(jié)直腸癌組織) 圖7 RPL4的qRT-PCR

3 討論

結(jié)直腸癌被認為是一種遺傳性疾病,腺瘤-癌序列是結(jié)直腸癌發(fā)展的基礎(chǔ)。目前,比較認可的靶向和免疫治療僅在有限的患者亞群中顯示出有效性[13]。由于這些原因,越來越需要定義個體患者的分子和生物學(xué)景觀,實現(xiàn)個體化治療極為迫切。本研究從多組學(xué)途徑發(fā)現(xiàn),RPL4是結(jié)直腸癌的預(yù)后生物標志物,可以有效地預(yù)測藥物治療療效。此外,本研究結(jié)果可以為進一步研究RPL4在結(jié)直腸癌進展機制中的潛在作用提供一些線索。

首先,本研究基于TCGA數(shù)據(jù)評估RPL4在結(jié)直腸癌中的表達水平,結(jié)果顯示,與正常結(jié)直腸組織比較,結(jié)直腸癌組織的RPL4表達水平明顯增加,配對差異分析也得到相同的結(jié)果,并且在單細胞測序水平上得到驗證。然后,本研究對結(jié)直腸組織進行了臨床樣本測試,qRT-PCR結(jié)果表明,RPL4在20個結(jié)直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織,進一步驗證了RPL4在結(jié)直腸癌中的mRNA表達水平上調(diào)。在HPA數(shù)據(jù)庫中對RPL4在蛋白水平表達進行驗證,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,RPL4在結(jié)直腸癌中的蛋白表達水平上調(diào)。上述研究結(jié)果表明,RPL4在結(jié)直腸癌中表達異常上調(diào),導(dǎo)致癌細胞的生長和增殖,與不良預(yù)后相關(guān)。

本研究與RPL4相關(guān)的潛在藥物敏感性分析表明,硝酸益康唑、貝利司他、帕博西尼等對開發(fā)RPL4靶點治療方面顯示出巨大潛力。Weng等[14]研究發(fā)現(xiàn),硝酸益康唑是一種抗真菌化合物,在胰腺癌方面有較多研究,益康唑可作為自噬抑制劑抑制腫瘤生長,通過調(diào)節(jié)ATF3/ID-1/AKT軸刺激自噬啟動,同時破壞溶酶體生物發(fā)生,從而誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌細胞中過度的自噬體積累和ER應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡。貝利司他是一種組蛋白去乙?；敢种苿?在2014年經(jīng)FDA認證用于治療復(fù)發(fā)或難治性外周T細胞淋巴瘤患者[15]。帕博西尼是CDK4/CDK6的抑制劑,一般與其他藥物聯(lián)合使用,治療激素受體呈陽性的晚期乳腺癌患者[16]。Sorokin等[17]臨床研究發(fā)現(xiàn),MEK抑制劑和CDK4/CDK6的抑制劑聯(lián)合使用可治療KRAS突變的結(jié)直腸癌患者,提高治療效果和安全性,并且揭示了靶向治療的耐藥機制。因此,本研究的結(jié)果和推導(dǎo)的假設(shè)可能為進一步深入研究提供一些線索。

綜上所述,核糖體基因RPL4有潛力成為用于結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后評估的新型生物學(xué)標志物。本研究初步對RPL4在結(jié)直腸癌的表達水平、富集分析和藥物敏感性進行研究,表明其作為癌癥預(yù)后生物標志物的潛在功能及其有效預(yù)測藥物治療反應(yīng)的潛在功能。雖然,本研究通過生物信息學(xué)分析確定了RPL4在結(jié)直腸癌中的潛在價值,但仍有不足,該項研究無法證明RPL4與這些預(yù)測藥物的直接相互作用。此外,本研究從在線數(shù)據(jù)庫中收集測序數(shù)據(jù)進行分析,這不可避免地存在一定的系統(tǒng)誤差。筆者認為,該項研究的進一步臨床應(yīng)用和機理研究需要通過實驗進行證明。