鄭玲　閆曉曼

摘要：為了研究甜瓜（Cucumis melo L.）GRAS基因家族的結(jié)構(gòu)特征、進化模式和生長發(fā)育過程中的表達模式，對甜瓜GRAS全基因組的基本信息、染色體位置、共線性、系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)、表達模式、順式元件進行了全面分析。結(jié)果表明，從甜瓜中鑒定出37個GRAS基因；這些基因在甜瓜的11條染色體上呈不均勻分布，并在6、7、8號染色體上出現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)；甜瓜GRAS家族可分為HAM、LS、SCR、SCL3、DELLA、LISCL、SHR、PAT1 8個亞族；基因結(jié)構(gòu)分析顯示，含有1～3個內(nèi)含子的基因有8個，沒有內(nèi)含子的基因有29個；啟動子分析，鑒定到生長素、脫落酸、赤霉素、低溫、干旱、光信號響應(yīng)作用元件以及參與分生組織和胚乳表達的元件；表達模式分析結(jié)果表明，HAM、DELLA亞族的基因幾乎在所有組織中都有表達，LS亞族在根和莖中表達含量較高，PAT1亞族在甜瓜的整個生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。得出結(jié)論，甜瓜全基因組共獲得GRAS基因 37 個，共可分為8個亞族，不同的亞族具有不同的基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達模式；不同亞族在甜瓜生長發(fā)育的不同階段具有差異性表達，它們共同參與調(diào)控甜瓜的發(fā)育過程。

關(guān)鍵詞：甜瓜；GRAS家族；生物信息學(xué)；表達模式

中圖分類號：S652.01文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0053-07

GRAS轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［1］，其名稱來自GAI、RGA、SCR［2］。GRAS蛋白由400～770個氨基酸殘基組成［3-4］，C端區(qū)域可以分為5個基序：LHRI、LHRII、VHIID、PFYRE、SAW，其中VHIID是GRAS蛋白的核心結(jié)構(gòu)，含有非常保守的P-N-H-D-Q-L單位，以L-R-I-T-G結(jié)尾［5］。富亮氨酸基序LHRI、LHRII分列于VHIID的兩側(cè)，PFYRE基序由3對蛋白序列特征P、FY、RE組成，R-E、W-G、W-W這3個保守氨基酸組成SAW基序［6］。GRAS轉(zhuǎn)錄因子的氨基末端序列差異較大，決定了GRAS蛋白在植物體中可以發(fā)揮不同的作用［7］。

近年來的研究表明，擬南芥有34個GRAS基因［8］，水稻有57個［9］、番茄有53個［10］、楊樹有106個［11］、大白菜有48個［12］、葡萄有43個［13］、無油樟有34個［14］、蘋果有127個［15］。GRAS轉(zhuǎn)錄因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、根徑向伸長、腋生枝分生組織、植物的應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［13，16］。

甜瓜（Cucumis melo L.）又稱香瓜，在我國廣泛種植，具有藥用價值和食用價值。甜瓜基因組數(shù)據(jù)在2012年已公布，但對甜瓜GRAS（CmGRAS）家族全基因組的研究還少之又少［17］。本研究對甜瓜GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族在基本信息、染色體定位、共線性、基因結(jié)構(gòu)、表達模式、順式元件和系統(tǒng)進化樹方面進行分析，旨在為研究甜瓜GRAS家族基因的功能提供重要參考。

1材料與方法

1.1甜瓜GRAS家族的鑒定

本試驗的研究對象是甜瓜GRAS家族。于2021年3月到6月在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物信息學(xué)實驗室（214）電腦上進行軟件操作和信息處理。在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.gao-lab.org/）和葫蘆科數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/）分別獲得甜瓜GRAS家族的信息，將兩者比對并刪除重復(fù)序列，確定候選基因。利用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）在線驗證候選基因，最終確定甜瓜GRAS家族成員。使用ExPASy（http//www.expasy.org/）網(wǎng)站獲取甜瓜GRAS蛋白的等電點（PI）、長度、分子量等理化性質(zhì)信息。利用Plant-PLo進行亞細胞定位。

1.2甜瓜GRAS家族基因在染色體上的分布

在Melonet DB網(wǎng)站（https：//melonet-db.dna.affrc.g-o.jp/ap/top）獲取甜瓜家族基因的染色體信息，制成模板，用MapInspect軟件制圖。

1.3甜瓜GRAS家族系統(tǒng)樹的構(gòu)建

利用 MEGA6.0軟件里提供的 Clustal W 工具對擬南芥、甜瓜GRAS氨基酸序列進行多序列比對，然后采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4甜瓜GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的共線性分析

在甜瓜數(shù)據(jù)庫中下載甜瓜GRAS家族的蛋白質(zhì)序列，在TBtools上做比對，再和甜瓜的GRAS基因文件進行比對，通過TBtools軟件進行共線性分析。

1.5甜瓜GRAS家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

從甜瓜數(shù)據(jù)庫獲得甜瓜GRAS家族的CDS序列和GENE序列，通過GSDS 2.0網(wǎng)站（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）制圖。利用MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/tools/meme）對CmGRAS的保守基序進行分析。

1.6甜瓜GRAS家族的啟動子分析

從甜瓜數(shù)據(jù)庫（CuGenDB）中下載GRAS家族基因的啟動子序列，通過PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtool-s/plantcare/html/）對其進行預(yù)測，得到制作甜瓜GRAS家族啟動子的相關(guān)信息，手動操作去除重復(fù)值。在GSDS 20網(wǎng)站進行檢索，制圖。

1.7甜瓜GRAS家族基因表達模式分析

在 Melonet DB網(wǎng)站根據(jù)甜瓜的基因序列號檢索出每個基因在甜瓜不同器官發(fā)育過程中的表達數(shù)據(jù)，選取甜瓜基因在根、莖、葉、雄花、雌花、果實、種子這7種器官中的表達數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件繪制基因表達熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1甜瓜GRAS家族成員的鑒定

利用InterPro鑒定出37個GRAS候選基因，在ExPASy網(wǎng)站分析得出等電點、長度、蛋白質(zhì)的分子量、親水性平均值、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等數(shù)據(jù)，再利用 Plant-PLo網(wǎng)站對甜瓜GRAS轉(zhuǎn)錄因子進行亞細胞定位。CmGRAS蛋白長度為104（CmGRAS14）～846（CmGRAS33）aa；蛋白質(zhì)分子量為11 950.08（CmGRAS14）～92 420.94（CmGRAS33） ku；等電點范圍為4.78（CmGRAS7）～8.73（CmGRAS14），其中2個大于7，呈堿性，35個小于7，呈酸性；37個CmGRAS的氨基酸序列均為不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)大于40；僅CmGRAS14的平均親水系數(shù)為正值，為疏水蛋白，其余均為親水蛋白；亞細胞定位顯示，甜瓜的37個GRAS基因全部在線粒體上。

2.2甜瓜GRAS家族基因的染色體定位與共線性分析

CmGRAS基因在11條染色體上分布不均，其中8號染色體上的基因數(shù)量最多，有6個；而10號、12號染色體上的基因數(shù)量最少，只有1個（圖1）。在同一條染色體上的物理位置小于或等于100 kb的同源基因就被認為是串聯(lián)重復(fù)的基因［18］。通過分析染色體定位圖和共線性分析圖（圖1、圖2），發(fā)現(xiàn)在6、7、8號染色體上存在串聯(lián)重復(fù)的基因，總共發(fā)現(xiàn)了28對共線基因（CmGRAS25/CmGRAS31；CmGRAS31/CmGRAS17；CmGRAS10/CmGRAS30等），5個串聯(lián)重復(fù)基因（CmGRAS4、CmGRAS5、CmGRAS20、CmGRAS21、CmGRAS22）。

2.3甜瓜GRAS家族系統(tǒng)進化樹的分析

參照擬南芥GRAS家族的亞族分類標準［8］，可將甜瓜的GRAS基因分為8個亞族（圖3）。甜瓜GRAS基因在亞家族中分布不均勻。HAM亞族是最大的亞族，包括7個CmGRAS成員；其次是SHR、PAT1亞族，有6個成員；最少的是SCL3亞族，只有2個成員。甜瓜GRAS家族存在2對同源旁系基因，分別是CmGRAS6/CmGRAS22、CmGRAS21/CmGRAS20。還確定了15對姐妹基因，分別是PAT1亞族中的5對，例如AtGRAS30/CmGRAS36、AtGRAS6/CmGRAS16等；SHR亞族中的2對，AtGRAS27/CmGRAS5、AtGRAS17/CmGRAS32；LISCL亞族中的1對，AtGRAS14/CmGRAS9；DELLA亞族中的1對，AtGRAS9/CmGRAS30；SCL3亞族中的1對，AtGRAS5/CmGRAS17；SCR亞族中的1對，AtGRAS21/CmGRAS33；LS亞族中的1對，AtGRAS7/CmGRAS14；HAM亞族中的3對，例如AtGRAS8/CmGRAS15。

2.4甜瓜GRAS家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

CmGRAS基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4）表明，甜瓜GRAS基因的最大內(nèi)含子數(shù)為3個，29個GRAS基因沒有內(nèi)含子，5個基因（CmGRAS6、CmGRAS8、CmGRAS19、CmGRAS24、CmGRAS29）只包含1個內(nèi)含子，CmGRAS14包含2個內(nèi)含子，CmGRAS27、CmGRAS33包含3個內(nèi)含子。保守基序分析結(jié)果（圖4）表明，37個CmGRAS都有Motif5、Motif6，體現(xiàn)了GRAS轉(zhuǎn)錄因子的高度保守。CmGRAS14中所含保守基序最少，只有2個（Motif5、Motif6）。除了CmGRAS14，其他蛋白序列都有Motif1、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6、Motif7。

2.5甜瓜GRAS家族基因表達模式分析

甜瓜GRAS家族基因在不同組織中都有表達（圖5）。CmGRAS1、CmGRAS28、CmGRAS26、CmGRAS31、CmGRAS36在根中表達量較高，CmGRAS1、CmGRAS30、CmGRAS21、CmGRAS13在莖中表達量較高，CmGRAS1、CmGRAS30在葉中表達量較高，CmGRAS2在花中表達量較高，CmGRAS25、CmGRAS23、CmGRAS3在果實中表達量較高，CmGRAS3在種子中表達量較高。CmGRAS25、CmGRAS30、CmGRAS1、CmGRAS34都位于DELLA亞族，在根、莖、葉、花、果實、種子中都有明顯表達，推測DELLA亞族調(diào)控了甜瓜多個器官的發(fā)育。PAT1亞族在花、果實、種子中表達量較高，推測它們可能參與了果實和種子的形成。LISCL亞族中的CmGRAS26和HAM亞族中的CmGRAS21、CmGRAS13、CmGRAS28在各個組織中都有表達，推測HAM亞族和SCL亞族廣泛參與了甜瓜的生長發(fā)育過程。SCL3亞族中的CmGRAS17在莖中有少量表達，推測其可能參與了莖的生長發(fā)育過程。

2.6甜瓜GRAS家族基因順式元件分析

甜瓜GRAS基因中的順式元件可分為4組（圖6）：（1）與光反應(yīng)有關(guān)的，包括ACE（參與光響應(yīng)的順式元件）、I-box（光響應(yīng)元件的一部分）；（2）與植物抗逆性有關(guān)的，包括TC-rich（與植物應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的元件）、LTR（與低溫脅迫有關(guān)的響應(yīng)元件）、ARE（應(yīng)對缺氧環(huán)境做出反應(yīng)的作用元件）、MBS（應(yīng)對干旱極端環(huán)境做出響應(yīng)的元件）；（3）與植物激素反應(yīng)有關(guān)的，包括ABRE（脫落酸傳遞和表達相關(guān)的作用元件）、TATC-box（赤霉素信號傳導(dǎo)元件）、AUXRR-core（生長素傳遞和表達的響應(yīng)元件）；（4）與時空基因表達有關(guān)的，包括circadion（與晝夜規(guī)律有關(guān)的作用元件）、CAT-box（參與分生組織表達的元件）、GCN4-motif（與胚乳表達作用相關(guān)的元件）。

CmGRAS17、CmGRAS14、CmGRAS7、CmGRAS21、CmGRAS37、CmGRAS35、CmGRAS4、CmGRAS29、CmGRAS2、CmGRAS31、CmGRAS36這11個CmGRAS基因中同時出現(xiàn)了ABRE，ABRE分布在所有的亞族中；AUXRR-core存在于CmGRAS36、CmGRAS15、CmGRAS33、CmGRAS8中。11個CmGRAS基因都出現(xiàn)了MBS，該元件除了不在SCR亞族中分布，其余各亞族均有分布；TATC-box只在CmGRAS4、CmGRAS5、CmGRAS31中有分布；ARE分布在每個亞族中，在LS亞族的CmGRAS6中分布最多；LTR分布在DELLA、HAM、SCR、LISCL、SHR這5個亞族中，其中在CmGRAS30中分布最多；CAT-box只在CmGRAS6、CmGRAS18、CmGRAS13、CmGRAS24、CmGRAS36中分布。

3討論

GRAS家族是一種重要的植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，在植物的生長和發(fā)育過程中有非常重要的作用［8，19］。甜瓜GRAS基因中，78%的基因沒有內(nèi)含子，22%的基因含有1～3個內(nèi)含子，可能是因為古老基因的水平已經(jīng)下降或現(xiàn)存的基因中不存在內(nèi)含子基因的復(fù)制現(xiàn)象［20］，而水稻、扁豆的基因中無內(nèi)含子基因的比例卻很少，沒有超過20%［21］。此外大多數(shù)的CmGRAS成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，表明CmGRAS基因的結(jié)構(gòu)高度保守。甜瓜37個GRAS基因的等電點范圍在4.78（CmGRAS7）～8.73（CmGRAS14）之間，其中2個大于7，呈堿性，35個小于7，呈酸性，與大麻GRAS基因等電點的性質(zhì)［22］基本一致。這表明，不同種類的GRAS蛋白可能存在相似的理化性質(zhì)。

甜瓜GRAS順式作用元件分析結(jié)果表明，ABRE和TC-rich在每個亞族中都有分布，AUXRR-core只在PAT1、SCR、HAM、DELLA亞族中分布，TATC-box只在SHR、PAT1亞族中分布。在小麥GRAS家族的順式作用元件中也發(fā)現(xiàn)參與了小麥光反應(yīng)和干旱脅迫反應(yīng)的元件，表明GRAS基因在植物光反應(yīng)及抗脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［23］。此外，甘薯中大多數(shù)GRAS基因（85.7%）含有與高溫壓力有關(guān)的響應(yīng)元件，大約25%的基因具有LTR，推測它們可能對低溫有較強的反應(yīng)，27%的基因含有參與鹽脅迫反應(yīng)的GT1-motif元件［24］。

擬南芥的SHR亞族和SCR亞族調(diào)控根部輻射形態(tài)的建成［25］，在甜瓜的SHR亞族中CmGRAS5是AtGRAS27的姐妹基因，SCR亞族中CmGRAS33/AtGRAS21是一對姐妹基因。基因表達分析結(jié)果表明，CmGRAS5、CmGRAS33在甜瓜的根部高度表達，推測其可能參與甜瓜根尖分生組織的生長，在維持根的生長中發(fā)揮關(guān)鍵作用。擬南芥的HAM亞族作用于植株頂部分生組織的發(fā)育［26］。甜瓜的HAM亞族中具有3對姐妹基因CmGRAS15/AtGRAS8、CmGRAS10/AtGRAS24、CmGRAS28/AtGRAS2。甜瓜GRAS家族基因的表達分析結(jié)果顯示，CmGRAS10、CmGRAS7、CmGRAS21、CmGRAS20這4個基因在莖中表達量較高，表明甜瓜的HAM亞族可能與擬南芥的HAM亞族具有類似的功能，也作用于甜瓜頂部分生組織的生長發(fā)育。

擬南芥PAT1亞族在光信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起調(diào)控作用［27］。對甜瓜GRAS基因家族進行啟動子分析發(fā)現(xiàn)，TATC-box光響應(yīng)元件也在PAT1亞族有分布，推測甜瓜的PAT1亞族也作用于光信號的傳導(dǎo)。擬南芥的DELLA亞族成員參與了赤霉素信號的傳導(dǎo)［28］，甜瓜GRAS家族基因的表達分析結(jié)果顯示，甜瓜的DELLA亞族基因各組織中都有表達，推測其通過赤霉素的信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控甜瓜的生長。

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