翟宇新 ，張斌強(qiáng)，錢航，徐先琳，唐俊，王雙雙，陳繼舜

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442008）

我國的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease,CAD）發(fā)病率及死亡率仍呈上升趨勢(shì)，是嚴(yán)重影響了人類健康的公共衛(wèi)生問題［1］。對(duì)CAD 的早期診斷以及病情評(píng)估可以改善CAD 患者的預(yù)后提高其生活質(zhì)量［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（LncRNA）和微小RNA（miRNAs）在心血管疾病的相關(guān)研究中具有重要地位，它們直接或間接的影響著CAD 的發(fā)生與發(fā)展［3-4］。其中長鏈非編碼RNA H19（LncRNA H19）和微小RNA 130a（miRNA 130a）通過調(diào)控多種機(jī)制參與心血管疾病的進(jìn)展［5-6］。目前LncRNA H19、miRNA 130a 在血漿中的表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)聯(lián)性沒有明確的研究，因此本研究擬分析臨床患者血漿中LncRNA H19 與miRNA 130a 的表達(dá)水平的變化，探究LncRNA H19 與miRNA 130a的表達(dá)水平是否與冠脈狹窄程度存在關(guān)聯(lián)性，旨在為CAD 的早期診斷及病情判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021 年7 月至2021 年10 月就診于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院心血管內(nèi)科且均行冠狀動(dòng)脈造影（CAG）明確冠狀動(dòng)脈血管情況的住院患者共92 例為研究對(duì)象，男48 例，女44 例，年齡≥18 歲，患者及家屬均知情同意。同時(shí)，院內(nèi)采集基礎(chǔ)資料及一般臨床生化指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎等重要臟器功能不良者；存在行為認(rèn)知障礙等無法完成知情同意的患者；對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響的其他血管疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

依據(jù)CAG 結(jié)果分為CAD 組（冠狀動(dòng)脈主要血管狹窄大于50%）和對(duì)照組（非CAD 組），冠狀動(dòng)脈造影根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)由二名有豐富經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師及以上職稱的醫(yī)生對(duì)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果進(jìn)行判定。根據(jù)Gensini 評(píng)分中位數(shù)［7］，將CAD 組進(jìn)一步分為2 個(gè)亞組：低分組，Gensini 評(píng)分＜40 分；高分組，Gensini 評(píng)分≥40 分。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 收集血液標(biāo)本 患者入院第二天清晨，收集空腹外周靜脈血5 mL，經(jīng)3 500 r/min 轉(zhuǎn)速持續(xù)離心15 min（美國Thermo Heraeus Pico 17/21 微量離心機(jī)），離心半徑10 cm，取部分上清液加Trizol混勻于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。? mL 靜脈血送檢驗(yàn)科檢驗(yàn)白蛋白、血尿酸、堿性磷酸酶、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 LncRNA H19 檢測(cè)將凍存血漿樣本使用 Trizol 法提取總 RNA 。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 水平；設(shè)計(jì)引物正向：5′-TGCTGCACTTTACAACCACTG-3′，反向：5′-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3′，內(nèi)參使用β-actin，正向引物：5′-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3′，反向引物：5′-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3′，依照 天根科技有限公司lnRcute lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（KR202）說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。每個(gè)樣本cDNA 取2 μL 加入天根科技有限公司lnRcute lncRNA 熒光定量檢測(cè)試劑上熒光定量PCR 儀檢測(cè)（博日實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀9600plus），PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，50℃10 s，72℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。應(yīng)用Taq-Man 探針實(shí)時(shí)定量熒光聚合鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和PCR 雙重特異引物擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)LncRNA H19 的Ct 值。

1.3.3 miRNA 130a 檢測(cè) 取凍存血漿樣本200 μL使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒（天根科技有限公司）分離出miRNA。使用設(shè)計(jì)成熟的miRNA 130a 的特異性引物（天根科技有限公司），并加入miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。每個(gè)樣本cDNA 取2 μL加入天根科技有限公司miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Green）（FP411）上熒光定量PCR 儀檢測(cè)，PCR 反應(yīng)條件為：95℃15 min，1 個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)miRNA 130a 的Ct 值。

所有目的基因表達(dá)倍數(shù)按2-ΔΔCt的公式計(jì)算得到。所有反應(yīng)重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25,P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 檢驗(yàn)分析兩變量間的相關(guān)程度和方向，取雙側(cè)檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估相關(guān)指標(biāo)對(duì)結(jié)局的診斷價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

通過CAD 組與對(duì)照組一般臨床資料比較可得出：兩組總膽固醇、HDL-C、LDL-C、白細(xì)胞等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 對(duì)照組與CAD 組患者一般臨床資料比較

2.2 不同組別血漿中LncRNA H19 及miRNA 130a 的表達(dá)情況

CAD 組血漿中LncRNA H19 表達(dá)水平高于對(duì)照組，miRNA 130a 表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。依據(jù)Gensini 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將CAD 組進(jìn)一步分為兩組，低分組30 例，高分組31 例，高分組血漿中LncRNA H19 表達(dá)水平高于低分組，miRNA 130a 表達(dá)水平低于低分組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、表3。

表2 對(duì)照組與CAD 組患者血漿LncRNA H19 及miRNA 130a 表達(dá)水平比較 ［M（P25,P75）］

表3 不同Gensini 評(píng)分患者血漿LncRNA H19 及miRNA 130a 表達(dá)水平比較 ［M（P25,P75）］

2.3 血漿中LncRNA H19 及miRNA 130a 表達(dá)水平與Gensini 評(píng)分的相關(guān)性分析

根據(jù)Spearman 檢驗(yàn)分析后可知，CAD 患者血漿中的LncRNA H19 表達(dá)水平與Gensini 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.481,P＜0.05），即LncRNA H19 表達(dá)水平越高，冠狀動(dòng)脈狹窄程度越重；而miRNA 130a的表達(dá)水平與Gensini 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.386,P＜0.05），即miRNA 130a 表達(dá)水平越低，冠狀動(dòng)脈狹窄程度越重。

2.4 血漿中LncRNA H19、miRNA 130a、二者聯(lián)合對(duì)CAD 及其嚴(yán)重程度的診斷效能

LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者聯(lián)合診斷CAD 的曲線下面積（AUC）分別為 0.685（95%CI：0.569～0.801，P＜0.05，靈敏性0.836，特異性0.452）、0.804（95%CI：0.701～0.908,P＜0.05，靈敏性0.903，特異性0.613）、0.821（95%CI：0.728～0.914,P＜0.05，靈敏性 0.918，特異性0.613）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步診斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度 的AUC 分別為0.777（95%CI：0.661～0.894,P＜0.05，靈敏性0.933，特異性0.516）、0.723（95%CI：0.597～0.850,P＜0.05，靈敏性0.516，特異性0.900）、0.836（95%CI：0.733～0.938,P＜0.05，靈敏性0.774，特異性0.867）。通過比較發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)LncRNA H19 或miRNA 130a 的AUC 值低于二者聯(lián)合的AUC 值，且靈敏性與特異性較二者單獨(dú)診斷有所提高，因此推斷二者聯(lián)合在一起具有更好評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄程度的效能，見圖1、圖2。

圖1 血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 及二者聯(lián)合診斷CAD 的ROC 曲線

圖2 血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 及二者聯(lián)合診斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度的ROC 曲線

3 討論

CAD 是臨床中常見的心血管疾病，其基礎(chǔ)病理改變是血管動(dòng)脈粥樣硬化引起管腔狹窄，可以導(dǎo)致心肌缺氧缺血從而引發(fā)心絞痛，嚴(yán)重時(shí)血管閉塞，甚至可引起心肌梗死，危及患者的生命［8］。早期診斷CAD，更積極地控制其危險(xiǎn)因素，可以改善患者預(yù)后。相關(guān)研究顯示，LncRNA 和miRNA 通過多種途徑影響著CAD 的發(fā)生發(fā)展。

Gensini 評(píng)分是目前臨床上評(píng)價(jià)冠脈狹窄程度的常用方法，冠狀動(dòng)脈病變?cè)絿?yán)重則Gensini 評(píng)分越高。本研究顯示，CAD 組及CAD 高Gensini 評(píng)分組患者血漿中LncRNA H19 的表達(dá)高于對(duì)照組。PAN 等［9］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化的患者血清中LncRNA H19 表達(dá)含量異常。提示血漿中LncRNAH19 的表達(dá)情況可能參與CAD 的發(fā)生發(fā)展。本次研究發(fā)現(xiàn)，隨著冠脈血管狹窄程度的增加，LncRNAH19 在血漿中的表達(dá)水平逐漸升高。相關(guān)研究顯示，LncRNA H19 的過表達(dá)可以促進(jìn)斑塊內(nèi)毛細(xì)血管形成，新生的毛細(xì)血管可以增加血管粥樣硬化區(qū)域的營養(yǎng)和局部的氧氣供應(yīng)，加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展［10-11］。在CAD 患者血清中，LncRNA H19 呈高表達(dá)，且與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平呈正相關(guān)。由此推測(cè)LncRNA H19 可能通過相關(guān)通路調(diào)控VEGF 的表達(dá)［12］。而在經(jīng)血清剝奪處理的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中，加強(qiáng)LncRNA H19 表達(dá)可以靶向抑制miR-199a-5p，雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)提示VEGF 是miR-199a-5p 下游的靶標(biāo)［13］。VEGF 可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、提高管壁通透性、介導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤等多種方式增加新生血管密度，進(jìn)一步加劇粥樣斑塊的不穩(wěn)定性［14］。另外有報(bào)道顯示，泡沫細(xì)胞中的LncRNA H19 過表達(dá)，可以抑制脂質(zhì)的代謝、增加脂類沉積，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞中的脂代謝紊亂，從而加重血管粥樣硬化［15］。結(jié)合上述相關(guān)研究推測(cè)：LncRNAH19 可能通過調(diào)控斑塊內(nèi)毛細(xì)血管的生成以及脂代謝紊亂的發(fā)生參與CAD 的進(jìn)展。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要條件之一［16］。有報(bào)道顯示，miRNA 130a可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡［17］。本次研究顯示，miRNA 130a 在CAD 組血漿中的表達(dá)低于對(duì)照組，提示miRNA130a 可能參與CAD 的發(fā)生。通過Gensini 評(píng)分進(jìn)一步將CAD 患者分為低分組和高分組，分析顯示，低分組、高分組血漿中miRNA 130a 的表達(dá)水平逐漸降低。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 130a 通過抑制人第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）來減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而影響了CAD 的發(fā)生發(fā)展［18-19］。同時(shí)有報(bào)道稱，在脂質(zhì)沉積的小鼠網(wǎng)膜脂肪組織細(xì)胞中miRNA 130a 呈高表達(dá)，這種相對(duì)含量變化提示miRNA 130a 可能參與了脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)，并影響了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程［20］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，用miRNA 130a 抑制劑處理的年輕血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致其衰老進(jìn)程加快，并降低其血管生成能力。與之相反的是，在衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞中提高miRNA 130a 的表達(dá)水平可減緩內(nèi)皮細(xì)胞的衰老進(jìn)程并改善血管生成情況［21］。內(nèi)皮細(xì)胞衰老會(huì)導(dǎo)致蛋白水解酶活性和降解速度均降低，膠原蛋白的合成和分解失衡，血管壁上膠原蛋白沉積以及彈性蛋白減少，造成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化［22］。這提示著miRNA 130a 可以通過延緩細(xì)胞衰老減緩CAD 的進(jìn)程。結(jié)合本次研究推測(cè)血漿中miRNA 130a 的表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)，miRNA 130a 可參與CAD 的發(fā)展演變，在一定程度上其表達(dá)水平變化可以反映CAD 嚴(yán)重程度。

有研究表明，血清中的LncRNA H19 對(duì)CAD有一定的診斷價(jià)值［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者聯(lián)合診斷CAD 的AUC分別為 0.685、0.804、0.821，證實(shí)血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 對(duì)CAD 具有一定的診斷效能，而二者聯(lián)合診斷CAD 預(yù)測(cè)效能較二者單獨(dú)診斷更高。在上述結(jié)論的基礎(chǔ)上，本次研究進(jìn)一步分析了血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者聯(lián)合對(duì)冠狀動(dòng)脈狹窄程度的診斷效能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LncRNA H19、miRNA 130a 以及LncRNA H19 聯(lián)合miRNA 130a 診斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度的AUC 分別為0.777、0.723、0.836。根據(jù)上述結(jié)果可以推測(cè)，LncRNA H19、miRNA 130a 可以在一定程度上診斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度，并且LncRNA H19 聯(lián)合miRNA 130a 診斷效能更高，這為CAD 的臨床診斷提供了新的思路。

綜上所述，LncRNA H19、miRNA 130a 與CAD 具有密切的關(guān)系，對(duì)于CAD 嚴(yán)重程度的早期診斷具有重大的意義。本次研究首次得出，隨著冠狀動(dòng)脈狹窄程度的增加，CAD 患者血漿中LncRNA H19 的表達(dá)水平升高，而miRNA 130a 的表達(dá)水平降低。由此可以推測(cè)，LncRNA H19、miRNA 130a 可以在一定程度上診斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度，并且LncRNA H19 聯(lián)合miRNA 130a 對(duì)冠狀動(dòng)脈狹窄程度診斷效能更高。這些指標(biāo)在診斷評(píng)估CAD 嚴(yán)重程度的發(fā)展中具有潛在的臨床參考價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。