王 麗 杜冬華 李忠浩 周 靜

（河北北方學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075131）

奶牛乳腺炎主要是一種由病原微生物感染引起的乳腺組織的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降。近年來(lái)，奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病率越來(lái)越高，使養(yǎng)殖業(yè)造成了經(jīng)濟(jì)損失[1]。臨床治療奶牛乳腺炎主要依賴抗生素，在早期取得了良好的治療效果，但隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致病原菌廣泛產(chǎn)生耐藥性，且藥物殘留問(wèn)題會(huì)危害人類(lèi)和動(dòng)物的健康[2]。此外，疫苗對(duì)乳腺炎的預(yù)防效果并不理想，也對(duì)該病的防治提出了更高要求[3]。因此，需要尋找和開(kāi)發(fā)治療奶牛乳腺炎新的有效藥物。

研究表明，炎癥細(xì)胞在乳腺組織聚集并分泌促炎細(xì)胞因子，是乳腺炎發(fā)生的先決條件[4-5]。諸多研究表明，激活的有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等釋放介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，且抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路可顯著緩解脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎[6]。此外，含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLRP3）炎性小體是最具特征性的炎癥體，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可促進(jìn)IL-1β 和IL-18 成熟[7]。因此，調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK和NLRP3 信號(hào)通路可能是治療奶牛乳腺炎的有效策略。中藥治療奶牛乳腺炎具有不易產(chǎn)生耐藥性、低殘留、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[8]。本研究所用自擬中藥方由黃芪、金銀花、蒲公英等14味中藥組成，經(jīng)課題組前期試驗(yàn)證明可治愈奶牛隱性乳腺炎（治愈率為63.38%，有效率為93.33%），增加產(chǎn)奶量[9]，但其抗炎機(jī)制尚未闡明。基于此，本研究旨在探究該中藥組方的抗乳腺炎的分子機(jī)制，以期為闡明該方劑的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

IL-1β、IL-8 和TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；兔抗牛NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65、p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK抗體，購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司；兔抗牛β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗牛ERK1/2、Phospho-ERK1/2、JNK1/2/3、Phospho- JNK1/2/3、NLRP3 抗體，購(gòu)自Affinity公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州宇恒生物公司；RIPA組織裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Beyotime公司。

全自動(dòng)活檢穿刺槍購(gòu)自美國(guó)Bard公司。

1.2 中藥乳房灌注劑制備

稱取黃芪、金銀花和蒲公英各30 g，大青葉、青皮、紫花地丁、王不留行、連翹、瓜蔞、赤芍、當(dāng)歸、乳香和通草各15 g，甘草10 g。按照本課題組在文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的方法制備，中藥煎劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至生藥濃度為1 g/mL。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在張家口某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的泌乳期為200 d左右的經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛（2～4 胎） 中，根據(jù)奶牛群改良報(bào)告（DHI）篩選出牛奶體細(xì)胞數(shù)（SCC）大于50 萬(wàn)個(gè)/mL（乳房和乳汁均無(wú)肉眼可見(jiàn)變化），且加利福尼亞乳腺炎試驗(yàn)（CMT）檢測(cè)陽(yáng)性的奶牛12 頭，隨機(jī)分為4 組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭牛。乳房灌注劑低、中、高劑量組奶牛于每天擠奶并用酒精棉球消毒乳頭后，每個(gè)乳區(qū)分別灌注10、20、40 mL自制中藥乳房灌注劑，1次/d，連用7 d；陽(yáng)性對(duì)照組奶牛的乳區(qū)在試驗(yàn)期間每天灌注40 mL滅菌ddH2O。另選取6頭SCC小于20萬(wàn)個(gè)/mL，且CMT 檢測(cè)陰性的奶牛，隨機(jī)分為2 組：正常對(duì)照組奶牛的乳區(qū)在試驗(yàn)期間每天灌注40 mL滅菌ddH2O；藥物對(duì)照組奶牛的乳區(qū)每天灌注40 mL中藥乳房灌注劑。

1.4 樣品采集

1.4.1 牛奶樣品的采集和乳清的分離

最后一次乳房灌注24 h后，使用75%酒精消毒乳區(qū)，并用滅菌毛巾擦干，棄去前三把奶，每個(gè)乳區(qū)用滅菌離心管收集10 mL；4 ℃、16 000 ×g 離心30 min，棄去上層乳脂收集乳清。將每頭牛4個(gè)乳區(qū)分離到的乳清混合，獲得均質(zhì)化樣品，-80 ℃保存。

1.4.2 奶牛乳腺組織樣品采集

參考文獻(xiàn)[10]方法采集乳腺組織，最后一次乳房灌注24 h后，各組奶牛乳房局部皮下用1%鹽酸普魯卡因浸潤(rùn)麻醉，用一次性滅菌組織取樣活檢針（14G×15 cm）采集乳腺組織（50～100 mg/頭）。將每頭奶牛的乳腺組織樣品置凍存管中，液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 促炎細(xì)胞因子水平

取1.4.1中分離到的乳清樣品，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)各組奶牛乳清中IL-1β、IL-8 和TNF-α含量。

1.5.2 炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取奶牛乳腺組織（50 mg/頭），加入200 μL RIPA 組織裂解液，組織研磨儀勻漿后于4 ℃、12 000 ×g 離心5 min，取上清。按常規(guī)方法將蛋白樣品變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE（20 μg/孔）并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。PVDF 蛋白膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后置于稀釋（1∶1 000）的NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、p-ERK1/2、Jun N-端激酶（JNK1/2/3）、p-JNK1/2/3、NLRP3 和β-actin 抗體中4 ℃孵育過(guò)夜。各蛋白表達(dá)量用Li-COR Biosciences 系統(tǒng)成像，根據(jù)各Western blotting條帶光密度值（IOD）分析其表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件采用單因素檢驗(yàn)中的Tukey's檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 自擬中藥方對(duì)牛乳中SCC、IL-1β、TNF-α 含量的影響（見(jiàn)表1）

表1 自擬中藥方對(duì)牛乳中SCC、IL-1β、TNF-α含量的影響

由表1 可知，正常對(duì)照組和藥物對(duì)照組牛奶中SCC均低于20 萬(wàn)個(gè)/mL，極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。經(jīng)乳房灌注治療后，中劑量組牛乳SCC 顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），高劑量組則降至正常，表明該灌注劑對(duì)奶牛隱性乳腺炎療效確實(shí)。

與正常對(duì)照組及藥物對(duì)照組相比，患隱性乳腺炎奶牛乳清中IL-1β、TNF-α 含量均極顯著升高（P＜0.01）。高劑量中藥乳房灌注降低了促炎細(xì)胞因子含量，極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)果表明，本研究制備的乳房灌注劑可抑制隱性乳腺炎病牛乳清中促炎因子含量。

2.2 自擬中藥方對(duì)乳腺組織中NF-κB和MAPK信號(hào)通路的影響（見(jiàn)表2）

表2 自擬中藥方對(duì)乳腺組織中NF-κB和MAPK信號(hào)通路的影響

由表2 可知，與正常對(duì)照組相比，患隱性乳腺炎奶牛的乳房組織中NF-κB p65和p38的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01），ERK 和JNK 的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中、高劑量中藥乳房灌注劑治療后降低或恢復(fù)了上述蛋白的磷酸化水平，以高劑量組效果最好，但與正常對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，中藥乳房灌注劑可抑制乳腺組織中NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活。

此外，NLRP3 的表達(dá)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與正常對(duì)照組及藥物對(duì)照組相比，患隱性乳腺炎奶牛乳腺組織中NLRP3的表達(dá)極顯著增加（P＜0.01），而中藥乳房灌注劑治療可顯著抑制乳腺組織中NLRP3的表達(dá)。

3 討論

3.1 自擬中藥方的藥理作用及其對(duì)牛乳SCC的影響

奶牛乳腺炎尤其是隱性乳腺炎的發(fā)病率逐年升高，每年均會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？股匾恢笔侵委熌膛Ｈ橄傺椎闹饕幬铮嬖谒幬餁埩?、新的耐藥菌出現(xiàn)等副作用[11]。中藥具有不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)殘留或低殘留、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[8]。已有研究表明，黃芪[12]、蒲公英[13]、金銀花[14]、瓜蔞[15]等具有抗菌消炎作用，可顯著改善奶牛乳腺炎臨床癥狀，增加產(chǎn)奶量，降低牛奶中SCC。本研究所用自擬中藥方中的主藥即為黃芪，具有益氣補(bǔ)虛作用；配合蒲公英、連翹、金銀花、紫花地丁、大青葉清熱解毒、消腫；輔以赤芍、瓜蔞、通草等活血散瘀、活絡(luò)通乳?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，雖然該方中藥物多具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎等作用，但其抗炎機(jī)制尚未明確。因此，在課題組前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步證明了使用該自擬中藥方制備的乳房灌注劑顯著降低了牛乳中SCC，表明其具有治療奶牛隱性乳腺炎作用，并進(jìn)一步探討了其對(duì)乳腺炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

3.2 自擬中藥方對(duì)乳清炎性細(xì)胞因子分泌的作用

TNF-α 和IL-1β 是典型的促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[16-17]。Qiu等[18]報(bào)道，乳腺炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并分泌炎性細(xì)胞因子是乳腺炎主要的病理特征。但有研究表明，與臨床型乳腺炎不同，患隱性乳腺炎奶牛的血清中IL-1β、TNF-α 和IL-8 等促炎細(xì)胞因子含量和正常奶牛并無(wú)差異[19]，而在乳清中升高，且與隱性乳腺炎發(fā)病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[20]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)奶牛乳清中TNF-α和IL-1β 的含量評(píng)估了中藥乳房灌注劑的抗炎作用，結(jié)果顯示，隱性乳腺炎陽(yáng)性奶牛乳清中TNF-α 和IL-1β 含量升高，中藥灌注劑治療后其水平恢復(fù)正常，提示該乳房灌注劑可抑制乳腺組織炎癥反應(yīng)。

3.3 自擬中藥方對(duì)隱性乳腺炎奶牛乳腺組織MAPK/NFκB和NLRP3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

NF-κB 是一種多亞基核轉(zhuǎn)錄因子，參與諸多免疫反應(yīng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中包括促炎細(xì)胞因子的基因[21]。此外，ERK、JNK 和p38 MAPK 家族亦參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的許多生理活動(dòng)，在促炎細(xì)胞因子的分泌中發(fā)揮重要作用[22]。已有研究證實(shí)，革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素可與Toll 樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路，進(jìn)而引起小鼠乳腺組織炎癥反應(yīng)[23]。因此，本研究進(jìn)一步探究了中藥乳房灌注劑對(duì)奶牛乳腺組織中NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路的作用，結(jié)果表明，該中藥乳房灌注劑能夠有效降低病牛乳腺組織中NF-κB、ERK、JNK 和p38 MAPK 的磷酸化水平，提示其抗炎作用可能與這些信號(hào)通路有關(guān)。

炎癥小體可啟動(dòng)組織對(duì)各種刺激的炎癥反應(yīng)，NLRP3 炎癥小體是迄今發(fā)現(xiàn)的研究最廣泛的炎癥體，可激活休眠的Pro-Caspase-1蛋白水解為活化的Caspase-1，從而將細(xì)胞因子前體Pro-IL-1β和Pro-IL-18分別轉(zhuǎn)化為成熟的、具有生物活性的IL-1β和IL-18[24]。鑒于NLRP3在炎癥過(guò)程中的重要作用，本研究進(jìn)一步探究了NLRP3在隱性乳腺炎病牛乳腺組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，中藥乳房灌注劑顯著抑制了NLRP3的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，自擬中藥乳房灌注劑可能是通過(guò)抑制NF-κB、MAPK、NLRP3 信號(hào)通路抑制了促炎細(xì)胞因子的分泌，而且不影響健康奶牛乳中SCC 和乳清中IL-1β 和TNF-α 含量以及乳腺組織中上述炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，表明該灌注劑是一種潛在的治療奶牛隱性乳腺炎安全有效的藥物，但其確切有效成分及其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。